DNS法測定茶葉中摻雜蔗糖含量

張珣，王婧，丁華，劉姣，楊潔，周有祥

（湖北省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所/農產品營養品質與安全湖北省重點實驗室，武漢 430064）

茶因其獨特的風味和保健功能而廣泛被人們所喜愛［1］。但有些茶葉存在嫩度差、外形疏松的問題，有些廠家在茶葉的制作過程中添加一定量的蔗糖，來達到固定茶葉外形、調節茶葉顏色、提高茶的甘甜，同時增加茶葉重量的目的。商家在茶葉中添加蔗糖不僅欺騙消費者，破壞茶葉市場次序［2］，而且使茶葉更易滋生細菌，帶來安全隱患［3］。建立可靠的外源蔗糖檢測方法顯得很有必要，目前文獻報道茶葉中外源蔗糖的檢測方法主要有高效液相色譜法［3，4］、液質聯用法［5，6］、近紅外無損檢測［7］、薄層色譜法［8］、酶法［9］、離子交換色譜［10］。高效液相色譜法具有靈敏、高效、穩定的優點，但需配有特定的檢測器，常用的有蒸發光散射檢測器［11-13］和示差檢測器［14］，此外還有脈沖安培檢測器［15］。液相色譜-質譜聯用法具有靈敏度高、選擇性好、測定快速準確的優點。近紅外無損檢測是在對收集的紅外光譜進行預處理和降維分析后，建立相應的模型，實現紅茶中外源蔗糖含量的判別和含糖量的在線實時檢測，該方法具有成本低、方便快捷的優點。薄層色譜法一般用于單糖的定性或半定量檢測；酶法檢測是基于某些單糖的酶促反應，例如蔗糖的水解、葡萄糖和果糖的磷酸化，根據酶促反應，測定樣品中葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、總多糖的濃度，該方法已被商品化，結果穩定，操作簡單，但效率低。離子交換色譜用于茶葉可溶性糖分析的檢測器多為安培檢測器，靈敏高效，但對樣品的前處理要求高。此外還有氣相色譜質譜聯用法［16］和毛細管電泳法［17］等。在上述方法中，除商品化的酶法檢測外，許多方法都有特定的儀器要求，不便于戶外或及時檢測，酶法檢測成本較高。

DNS比色法測蔗糖含量的原理為蔗糖等雙糖在酸性條件下經加熱處理水解成還原糖。還原糖和過量的3，5-二硝基水楊酸在堿性環境下加熱，將3，5-二硝基水楊酸還原成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸（圖1）。在一定的濃度范圍內，還原糖的濃度與溶液棕色程度成正比，用分光光度計測定其吸光度，可得到線性方程，從而可以對還原糖進行定量分析［18］。

圖1 DNS法測還原糖原理

本研究在DNS法測還原糖的基礎上以及在果蔬中已有相同原理標準執行的前提下，提出DNS法測茶葉中的蔗糖，具備一定現實基礎。初步建立了檢測茶葉中摻加蔗糖的方法，在有一定數據基礎上能很好鑒別出添加了外源蔗糖的茶葉，同時對設備要求不高，方便隨時隨地檢測，為茶葉外源蔗糖的檢測提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 儀器

SIGMA3K15型離心機，SHZ-82A型水浴鍋，HITACHI U-3900型紫外可見分光光度計，AL204電子分析天平，IKA A11研磨機。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制備

1）3，5 -二硝基水楊酸（DNS）試劑。將6.3 g DNS和262 mL 2 mol/L氫氧化鈉溶液加入到含185 g酒石酸鉀鈉（C4H4O6KNa·4H2O）的500 mL熱水中，再加5 g苯酚和5 g亞硫酸鈉（Na2SO3），攪拌使其冷卻，用水定容至1 000 mL，貯于棕色瓶中備用。

2）1 mg/mL葡萄糖標準溶液。準確稱取0.100 0 g經80℃干燥2 h的葡萄糖（C6H12O6）標準物質，溶解定容至100 mL，現配現用。

3）亞鐵氫化鉀溶液。稱取10.6 g亞鐵氫化鉀［K4Fe（CN）6·3H2O］去離子水溶解定容至100 mL。

4）乙酸鋅溶液。稱取21.9 g乙酸鋅［Zn（OAc）2·2H2O］，用少量去離子水溶解后加入3 mL冰乙酸，用去離子水定容至100 mL。

5）6 mol/L鹽酸溶液。在500 mL燒杯中加入100 mL去離子水，量取100 mL鹽酸緩緩加入燒杯中，邊加邊攪拌，混勻后裝入儲液瓶備用。

1.2.2 標準曲線的繪制 用移液管分別準確吸取0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2 mL葡萄糖標準溶液于6支10 mL具塞刻度試管中，加去離子水使溶液體積補至2.0 mL，加入4.00 mL 3，5-二硝基水楊酸試劑，置沸水浴中加熱5 min。取出，立即置冷水中，冷卻至室溫，定容，搖勻。所得系列葡萄糖標準溶液濃度分別為0、0.02、0.04、0.08、0.10、0.12 mg/mL。用分光光度計測定540 nm吸光度。以葡萄糖濃度（mg/mL）為橫坐標（x），吸光度為縱坐標（y），繪制標準曲線。

1.2.3 還原糖的測定 取1 mL待測樣品于10 mL比色管中，補水至2 mL，加入4 mL DNS試劑，沸水浴5 min，定容至10 mL，540 nm下測吸光度，對照標準曲線計算還原糖含量。

1.2.4 淋洗與浸泡測茶葉蔗糖方法的比較 茶葉中若摻雜蔗糖，有2種基本的方法可以將內部蔗糖溶解出來，即淋洗法和浸泡法。為比較淋洗法和浸泡法對蔗糖的提取能力，取摻雜蔗糖茶葉樣品，設計如下試驗。

1）淋洗茶葉茶湯的蔗糖含量測定。①還原糖的測定：取5 g左右預先處理（加糖或不加糖）的一批茶葉流水淋洗10 s，取濾液，加入乙酸鋅和亞鐵氰化鉀除去蛋白質，定容至100 mL，過濾，取濾液按“1.2.3”方法測還原糖含量，每個樣品3個平行。②蔗糖的測定：取上述濾液50 mL，加入5 mL鹽酸，68℃水浴振蕩15 min，測還原糖量［19］。計算2次還原糖量之差，計算轉化糖含量，從而得出蔗糖含量，每個樣品3個平行。

2）浸泡茶葉茶湯中蔗糖含量的測定。①還原糖的測定：取5 g左右預先加糖處理的茶葉加入50 mL的去離子水，置于45℃水浴鍋中，振蕩浸提1 h，取茶湯，3 000 r/min離心3 min。過濾茶湯，定容至100 mL，適當稀釋后用于還原糖測定，每個樣品3個平行。②蔗糖的測定：上述茶湯定容后剩余的50 mL茶湯，加入5 mL的6 mol/L鹽酸，68℃水浴振蕩15 min，測還原糖量，計算2次還原糖之差，利用差值計算蔗糖含量，每個樣品3個平行。

1.2.5 方法檢出限與回收率試驗 取3份已知蔗糖含量的茶葉樣品，分別按每5.00 g茶葉向其中添加1、10、50 mg蔗糖，粉碎攪拌均勻，按浸泡茶葉測茶湯中蔗糖含量，每份測量3次，得到檢出限計算回收率。

1.2.6 精密度試驗 同時取5份相同樣品按浸泡茶葉測茶湯中蔗糖含量，并計算標準偏差RSD。

1.2.7 樣品的檢測與分析 根據工廠添加蔗糖方式，選取在茶葉揉捻時分別添加不同質量蔗糖，在50 kg鮮葉中分別添加1、2、3 kg蔗糖，制備最終添加蔗糖含量分別為9.3%、18.5%、22.1%的樣品，以不添加蔗糖樣品為對照，測4份樣品中蔗糖含量。同時取市場上16份茶葉樣品，測蔗糖含量，比較差異，分析可能添加蔗糖種類。

2 結果與分析

2.1 繪制標準曲線

葡萄糖的質量濃度在0～0.12 mg/mL與其吸光度呈良好的線性關系，線性回歸方程為y=16.04x-0.02，相關系數r為0.996（圖2）。

圖2 葡萄糖標準曲線

2.2 淋洗茶葉測得蔗糖含量

茶葉樣品在經過短暫的流水淋洗后，表面的蔗糖部分溶于水中，在茶葉前處理上能節約時間。茶葉為已知樣品，由表1可以看出，2號和5號樣品蔗糖含量少，1號、3號、4號蔗糖含量多，為添加蔗糖樣品。試驗結果與實際蔗糖添加情況相符，在茶葉本身蔗糖含量相差不大的情況下能有效區分額外添加蔗糖的茶葉樣品。

表1 淋洗茶蔗糖含量

2.3 浸泡茶葉測得蔗糖含量

由表2可以看出，相較于淋洗茶湯，浸泡茶湯的蔗糖含量整體提高，說明大部分蔗糖沒有被淋洗下來。但結果同樣表明，2號和5號茶葉蔗糖含量低，1號、3號、4號含量高，與預期相符。考慮到不同茶葉的溶解速度不一樣，經相同的淋洗過程，自身或添加蔗糖被淋洗的情況會有所不同。綜合考慮，淋洗操作節省時間和資源，但試驗結果受茶葉本身影響更大，可以作為初步定性的參考；浸泡茶葉需要時間長，測得更準確，能滿足定量的需要，后續將對浸泡法進行相關研究。

表2 浸泡茶蔗糖含量

2.4 方法檢出限與回收率

試驗以文獻［18］的方法為基礎，DNS方法的檢出限為2.0 mg/L，線性范圍為0～120.0 mg/L。由于茶葉成分復雜，通過試驗確定蔗糖的檢出限較為可信，分別添加1、10和50 mg的蔗糖。結果如表3所示，當添加量為1 mg時，測量誤差大于測量值，在實際操作中無法反映出正確結果；當添加蔗糖為10 mg時，回收率117.60%，結果較為可靠，方法對添加蔗糖的檢出限為2 mg/L。

表3 檢出限與回收率

添加1 mg蔗糖，方法回收率低，相對偏差高，無法區分是否添加蔗糖，在添加蔗糖10 mg時，回收率較好，但RSD為9.18%，較大的相對偏差顯示檢測數據存在較大波動，原因是檢測方法存在一定誤差，當檢測值較小時，相對偏差就大。當添加量為50 mg時，RSD明顯減小。整體上當外源蔗糖添加量為10 mg時，該方法已經能準確定量檢測。

2.5 精密度試驗

取5份茶葉樣品各5.00 g浸泡并檢測，試驗結果見表4。由表4可知，DNS法的精密度好，以茶葉中蔗糖（可溶性糖折算而來）為檢測對象，該方法的RSD為2.47%。

表4 精密度試驗結果

2.6 樣品的檢測與分析

在對市場上的16份茶葉樣品（編號為1～16）檢測后發現，不同茶葉蔗糖含量存在一定差異。一些茶葉蔗糖含量計算得到負值，是由于茶葉本身蔗糖含量低，測量存在一定誤差。樣品經多次檢測仍為負值，說明是系統誤差所致。分析茶葉樣品數據可知這些茶葉蔗糖含量在0～21.29 mg/g（表5）。揉捻過程添加蔗糖的3份樣品（編號為18～20，17號為對照）測得蔗糖含量分別為44.99、112.66、141.50 mg/g，計算回收率分別為48.4%、60.9%、64.0%。

表5 樣品檢測結果

經調查研究，要達到收縮茶葉外形和提升茶葉光澤度的目的，鮮葉的加糖量通常在5%左右。有文獻報道在5%～25%［12］。其中5%的蔗糖添加至鮮葉中，折算成干葉其添加蔗糖量在9.26%左右，DNS法測得結果為44.99 mg/g，說明檢測結果在44.99 mg/g以上，則可能為添加蔗糖樣品，這一結論與陳琦等［2］的研究結果一致。

3 討論

研究建立了茶葉中蔗糖的DNS測定方法，并運用在實際的樣品檢測中。能明顯區分添加量為2 mg/g的蔗糖樣品，實現定量檢測，酸解3，5-二硝基水楊酸法在食品糖類檢測中應用廣泛，方法成熟，但食品基質成分復雜，茶葉中尤為明顯，本研究開拓了其在茶葉蔗糖檢測中的應用。但同時方法存在一定局限，主要表現在以下方面。同幾乎所有測茶葉外源糖的方法一樣，方法測定的是茶葉總的含糖量，對于是否添加蔗糖作出的是可能性的判斷，不同茶葉本底影響不同，要給出合理的判斷值需要更多的數據支持；方法前處理比較復雜，有待精簡。淋洗法在添加蔗糖量較大時，可以粗略地測定區分樣品，優點在于節省提取時間，樣液基質更為簡單，缺點是方法靈敏度不夠。

DNS法在直接測還原糖含量時，相比酸解后再測還原糖結果的穩定性更好，有些茶葉蔗糖含量出現負值，可能是酸解操作給試驗帶來干擾。

在2次添加回收試驗中，得到不同的回收率，一次在成品茶葉添加蔗糖，一次在茶葉制作過程中添加蔗糖，后者回收率較前者低，部分原因在于揉捻可使蔗糖滲入茶葉內部，增加提取難度。本方法在前處理上缺少優化試驗，如水浴時間、料液比、提取介質、提取次數等，但鑒于試驗結果已滿足預期，不再進行優化試驗。