LncRNA對胚胎發育的影響

張燕迪，任紅艷，畢延震

（湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所/動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，武漢 430064）

隨著對基因轉錄的深入研究及高通量測序技術的廣泛應用，不斷有研究表明多數物種的基因組普遍被轉錄，導致LncRNA的不斷產生。最開始，研究者認為LncRNA作為轉錄的副產物被表達出來，是基因序列中的“垃圾”，沒有任何的生物學功能。但是，隨后的研究中不斷有證據表明LncRNA能夠調控基因表達，是多種生物學過程的重要調節劑。近年來利用RNA-seq技術對哺乳動物著床前胚胎進行測序，發現有大量LncRNA表達，這些LncRNA在早期胚胎發育的不同階段具有明顯的時空表達特異性［1］。進一步研究證明LncRNA對胚胎正常發育具有重要調節作用，它參與生物體生長、發育、衰老、死亡等各種生物進程，其功能的異常會導致相關疾病發生［2-4］。目前為止，只有少數研究解析LncRNA對胚胎發育的功能，對于LncRNA在胚胎發育中的具體作用機制認識還不夠全面。

1 LncRNA簡介

LncRNA是一類轉錄本長度大于200核苷酸（Nucleotide，nt）、無蛋白質編碼能力但具有生物學功能的RNA［5］。由日本科學家Okazaki等［6］通過對小鼠cDNA文庫進行大規模測序時首次發現并命名。隨機復制、染色體重排、轉座子隨機插入、逆轉錄轉座作用和蛋白編碼基因閱讀框的改變是LncRNA產生的五種機制［7］。LncRNA與mRNA相似，由RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymeraseⅡ，RNAPⅡ）轉錄，有5′端帽子、3′端多聚腺苷酸（polyA）尾［8，9］。與mRNA不同的是，大多數LncRNA外顯子數目少且較長，主要在細胞核內表達，保守性和表達豐度低，在細胞和組織中呈現特異性表達模式［10，11］。LncRNA分類標準多樣，根據LncRNA與蛋白質編碼基因在基因組上的相對位置分為正義鏈LncRNA（sense LncRNA）、反義鏈LncRNA（antisense LncRNA）、雙向鏈LncRNA（bidirectional LncRNA）、內含子LncRNA（intronic LncRNA）和基因間LncRNA（intergenic LncRNA）五類［12］。根據LncRNA發揮的生物學功能分為信號分子（signal molecule）、引導分子（guid molecule）、支架分子（scaffold molecule）和誘餌分子（decoy molecule）［13，14］。cRNA在表觀遺傳學、轉錄、轉錄后水平調控基因表達，在基因組印記、X染色體失活、細胞周期調控等過程中起著重要作用［15，16］。

LncRNA通過表觀遺傳修飾（Epigenetic modification）參與轉錄前調控，就是通過DNA甲基化、組蛋白甲基化及乙酰化等調節有關基因表達［17］。LncRNA-Xist招募多梳蛋白抑制復合體2（polycomb repressive complex 2，PRC2）到X染色體，與AUCG四環結構作用，激活染色質修飾復合體中的甲基轉移酶，引起組蛋白H3賴氨酸27三甲基化（H3K27me3），導致X染色體失活。LncRNA-Xist還可以與SHARP相互作用促進這種沉默［18］。來源于與胚胎發育相關的HOX基因座的LncRNA-HOTAIR與LSD1（賴氨酸特異性脫甲基酶1）和PRC2結合后，靶向基因組，引起H3K27甲基化和H3K4去甲基化，抑制基因表達［18，19］。

LncRNA主要通過調節增強子或啟動子活性、轉錄因子及絕緣子功能等介導基因轉錄水平的調控。從增強子反義鏈轉錄來的LncRNA-Evf2通過與Dlx2形成RNA-蛋白質復合體，激活Dlx5和Dlx6的 增 強 子，促 進Dlx5和Dlx6基 因 表 達［20，21］。LncRNA-Airn能夠覆蓋在Igf2r啟動子上，通過連續轉錄，阻止Igf2r啟動子的轉錄起始。同時，Airn通過募集組蛋白甲基轉移酶EHMT2到基因組的基因座上來調控Slc22a3表達［22］。有研究稱脂多糖誘導的非編碼RNA（LINoCR）通過解除下游絕緣子對增強子的抑制而激活靶基因LYZ的表達［23］。

LncRNA通過影響mRNA轉運、剪接、降解等過程在轉錄后水平調控基因表達。LncRNA-MALAT1通過與SR（serine-and arginine-rich proteins family，富含絲氨酸/精氨酸的剪接調控蛋白家族）蛋白作用調節剪切因子磷酸化狀態，使前體mRNA發生選擇性剪切［24］。LncRNA-1/2-sbs RNA與3′端非編碼區含有Alu元件的mRNA結合，促進mRNA與STAU1結合，引起Staufen1介導的降解（Staufen1-mediated decay，SMD）途徑，導致mRNA降解［25］。LncRNANEAT1可以調控已經分化細胞中有關mRNA的核質轉運［26］。高表達于胃癌細胞中的LncRNA-GHET1能提高c-MycmRNA的穩定性，促進其表達，進而影響細胞的增殖［27］。

2 胚胎發育簡介

動物的胚胎發育是一個連續發展變化的過程，精卵融合使得父源遺傳物質進入成熟卵母細胞，在生物學中將已受精的卵母細胞稱為受精卵，其是由一個細胞組成的胚胎，包含著生物體生長發育所需的全部信息，在母體環境合適的條件下，經過卵裂期→桑椹胚→囊胚→原腸胚，有組織地對這些信息進行編碼修飾，最終增殖發育成為一個新的個體［28］。胚胎發育過程復雜且有序，是在許多編碼蛋白基因和非編碼蛋白基因選擇性特異時空表達及其表達產物相互作用形成精確調控網絡的條件下完成的，某些基因的改變可能會引起胚胎發育異常，甚至導致先天畸形的發生，因此研究胚胎發育時期LncRNA調控功能具有重要作用。

胚胎發育過程中有一系列重要且獨特的事件影響著胚胎的正常發育，例如MZT，其通過兩個相互關聯的過程將終末分化的精子和卵母細胞重編程到全能性，即母體蛋白及轉錄本mRNA的消除和胚胎發育所必需的ZGA［29，30］。從精子與成熟卵子受精到胚胎第一次分裂，胚胎發育是由卵母細胞中積累的母源RNA和蛋白質控制的，二細胞形成后，母源物質的表達下調，合子基因產生，合子基因組逐漸發揮主要調控作用，發育由母源基因產物控制轉向合子基因產物控制，若這個過渡不能順利完成，就會造成胚胎發育的阻滯。由于原始存留的蛋白質和RNA量及種類的不同，導致各物種之間MZT所處的時間點不同［31］。合子基因組激活也是一個很重要的過程，改變了胚胎內基因組的表達模式，是胚胎具備形成各種細胞類型能力的關鍵，與染色質狀態、細胞周期、核質成分比例變化等胚胎事件協調發生。ZGA通常包括兩個階段，開始的低水平轉錄和隨后的爆發式表達。有三類模型用于研究ZGA的調控機制：第一類是母源調控模型；第二類是核質比模型；第三類是染色質重塑模型［32］。Assou等［33］研究表明內細胞團和滋養層分離也是胚胎發育過程中的一個重要事件。

3 LncRNA參與胚胎發育

在胚胎發育過程中，通過胚胎和祖細胞中關鍵基因的精確時空激活來實現細胞譜系的規格和分化。不斷有研究發現動物和人類植入前胚胎中存在一些與胚胎發育相關的LncRNA，但其功能研究相對缺乏。敲除牛胚胎中某些特定的LncRNA會影響胚胎的生長，導致胚胎發育率的提高和囊胚體積的增大。利用鎖核酸（Locked nucleic acid，LNC）對豬胚胎發育中的lincRNA-TCONS-00166370進行功能缺失實驗，發現TCONS-00166370影響胚胎正常紡錘體的形成，造成豬早期胚胎卵裂異常［34］。在小鼠中，siRNA介導的啟動子相關LncRNA（promoter-associated noncoding RNAs，pancRNAs）沉默在二細胞期胚胎中特異表達，導致胚胎死亡，這種表型可以通過表達與這種LncRNA相互作用的蛋白質來挽救。對人植入前胚胎單細胞和人胚胎干細胞（hESCs）RNA-seq數據的 分析 表明，有3 405個LncRNAs表達，其中2 733個是潛在的基因間非編碼RNA。進一步研究發現早期人類胚胎和分化細胞中有相當明顯的LncRNA譜，LncRNAs是人類早期胚胎發育過程中轉錄表達動態變化的一部分，也是胚胎發育過程中形態發生劇烈變化的原因之一。由于在胚胎發育的特定和關鍵階段檢測到了一些LncRNAs，所以它們可作為胚胎發育能力和ZGA的候選標記物［35］。上述研究結果表明LncRNA在胚胎發育過程中具有重要作用，但大部分LncRNA的功能和機制還需進一步研究。

3.1 LncRNA參與卵母細胞成熟與精子發生

卵母細胞質量影響著胚胎發育能力，卵母細胞中的LncRNA對卵母細胞起到調控作用。Yerushalmi等［36］報道在生發泡期（germinal vesicle，GV）和成熟（MII）期卵母細胞以及高質量和劣質的植入前胚胎中，都有特異性LncRNA在卵丘細胞中差異表達，而且這些LncRNA在胚胎發育過程中呈現動態變化。此外，與無多囊卵巢綜合征的女性相比，多囊卵巢綜合征患者的卵丘細胞異常表達LncRNA，提示LncRNA的表達可能影響卵母細胞的能力。LncRNA可通過調節卵母細胞減數分裂、高度不飽和脂肪酸的合成、細胞表面信號傳導以及顆粒細胞表面蛋白參與細胞粘附等過程，從而調節卵母細胞成熟。LncRNA的表達譜不僅可以反映胚胎的發育階段，也可以反映顆粒細胞和卵丘細胞的發育階段，用實時定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（Real time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術對卵丘細胞中表達的LncRNA進行分析［35］。精子是由精原干細胞分化而來的，研究報道Mrhl（Miotic recombination hot spot locus）、Neat1（Nuclear paraspeckle assembly transcript 1）和HongrES2等LncRNA調控精子發生過程。Mrhl通過與p68相互作用抑制Wnt通路，從而調控精子發生，干擾Neat1的表達會降低曲精小管中精子含量，HongrES2利用其產生的一段與miRNA類似的片段抑制CES7表達，導致精子獲能受到影響［14］。

3.2 LncRNA參與合子基因組激活

合子基因組激活（ZGA）對胚胎發育具有重要作用，LncRNA參與調控ZGA過程。Wang等［37］發現與內源逆轉錄（Endogeneous retrovirues，ERVs）相關的Linc-GET對小 鼠ZGA過程至 關重 要，Linc-GET表達于小鼠胚胎著床前二細胞晚期到四細胞階段，其通過與ILF2（Interleukin enhancer binding factor 2）、FUBP1（Far upstream element binding protein 1）及hnRNPU（Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U）形成RNA-蛋白質復合物，啟動ERVK、GLN和MERVL長末端重復序列順式調控活動，同時可降低ILF2、FUBP1和hnRNPU的表達，抑制RNA的可選擇性剪接。功能缺失實驗結果表明，Linc-GET缺失不僅會抑制MAPK信號通路，也會造成小鼠胚胎阻滯于二細胞時期G2階段。所以說Linc-GET對小鼠胚胎二細胞階段正確轉錄、合子激活、RNA可變剪接具有重要的調控作用。Hamazaki等［38］研究發現ZGA時期特定的LncRNA-Il17d（pancRNA）能夠順式增強其鄰近蛋白質編碼基因白細胞介素家族成員Il17d的表達，從而驅動后續胚胎發育，敲低LncRNA-Il17d會導致胚胎死亡，過表達Il17d可以挽救上述致死現象。Linc28也被認為是人和小鼠EGA網絡中的一個關鍵基因，其缺失會造成小鼠胚胎二細胞到四細胞階段的發育停滯。LncRNA-Gtl2在胚胎發育不同時期的表達模式及亞細胞定位有所變化，其對胚胎發育具有潛在重要作用，對囊胚細胞分化和體外擴張能力有影響，干細胞多能性因子和組蛋白修飾可以調控其表達［39］。以上研究表明LncRNA參與調控胚胎發育。

3.3 LncRNA參與調控胚胎干細胞多能性

胚胎干細胞（Embryonic stem cells，ESCs）是具有多能性和自我更新能力的細胞，其可以分化為任何一種身體細胞類型，在研究胚胎發育過程中具有重要作用。為了研究LncRNA在ESCs中的作用及機制，研究人員通過微陣列和Chip-seq實驗，在小鼠體內獲得了第一批將LncRNA與ESCs調控聯系起來的數據，研究表明，小鼠ESCs具有特定的LncRNA信號在分化過程中丟失，Guttman等［40］在小鼠ESCs中發現了1 000多個能夠編碼基因的LncRNAs。其中許多LncRNAs是由多能相關轉錄因子Sox2（sex determining region Y）、Oct4（Octamer-binding transcription factor 4）和Nanog調控，LncRNA表達水平的變化會改變Sox2、Oct4和Nanog的表達，導致小鼠ESCs發生轉錄組變異，進而影響ESCs多能性和分化。以上研究表明LncRNA參與調控胚胎干細胞多能性，其機制主要有結合表觀修飾物、吸附miRNA、與RNA結合蛋白作用這三種［14］。

4 展望

由于LncRNA所具有的多種分子生物學功能和其表達的時空特異性，有理由相信LncRNA在胚胎發育過程中起著關鍵作用，但目前的研究多局限于LncRNA與疾病相關的方面，LncRNA參與調控胚胎發育的研究仍處于早期階段，與胚胎中已發現的LncRNA數量相比，現有的研究成果遠遠不夠，其如何調控胚胎發育過程的機制至今尚不完全清楚，有待科研工作者進一步研究。所以鑒定多種物種胚胎中更多的LncRNA，并闡明關鍵LncRNA的調控機理將會是今后的主要研究方向，這將為疾病的早期預警及控制治療提供參考，為解決醫學難題開創新思路。