長雄野生稻與栽培稻種間雜種胚拯救研究初報

査中萍，鄭興飛，周黎，王紅波，殷得所，胡建林，董華林，游艾青，徐得澤

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所/糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064）

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，世界上有超過50%的人口以稻米作為主要食物來源。長期的人工選擇造成栽培稻品種育種資源過于狹窄，水稻育種出現(xiàn)了產(chǎn)量、抗性、品質(zhì)難以進(jìn)一步突破的“卡脖子”難題。打破這種局面的最好辦法就是增加品種的遺傳多樣性。野生稻作為常規(guī)栽培稻的原始祖先，在其漫長的進(jìn)化過程中，為了適應(yīng)不同的地理區(qū)域和復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境，逐步形成了抗病、抗蟲、抗逆等多種優(yōu)良特性［1-8］，其中長雄蕊野生稻是現(xiàn)在栽培稻的野生近緣種，保存了許多常規(guī)栽培稻中沒有的或者已經(jīng)消失的優(yōu)良基因［9-13］。因此，長雄蕊野生稻可以作為一種優(yōu)異的種質(zhì)資源來改善當(dāng)今栽培稻品種遺傳基礎(chǔ)狹窄的局面。近年來，許多以稻米為主食的發(fā)展中國家人口越來越多，而耕地面積越來越少，于是科學(xué)家們逐漸把注意力轉(zhuǎn)向發(fā)掘和利用長雄蕊野生稻的一些有利性狀，來拓寬栽培稻品種，從而改良現(xiàn)有的栽培品種，提高水稻的品質(zhì)和產(chǎn)量。但長雄野生稻自交幾乎不結(jié)實(shí)，長雄野生稻與栽培稻雜交時很難產(chǎn)生可育雜種，表現(xiàn)出很強(qiáng)的生殖隔離特點(diǎn)，因此提高長雄野生稻與栽培稻雜交種的成苗率，有效獲得長雄野生稻與栽培稻的雜交后代對于有效利用長雄野生稻具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

長雄野生稻W(wǎng)29、W32、W35為本課題組經(jīng)多年在湖北武漢和海南陵水兩地稻蔸繁殖留存。優(yōu)良栽培稻恢復(fù)系IP094、IP095、IP098，于2020年5月10日每間隔10 d分期播種，于8月10日至9月15日進(jìn)行長雄野生稻與栽培稻雜交授粉。雜交后套袋，雜交袋標(biāo)注父本、母本名稱及授粉日期。

1.2 方法

1.2.1 幼胚消毒接種 栽培稻與長雄野生稻授粉5～9 d后收取雜交后的種子，剝?nèi)シf殼，將去除穎殼的雜交種放在滅菌的50 mL三角瓶中，在超凈工作臺上進(jìn)行雜交種消毒。首先用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇表面消毒雜交種，再用有效氯含量為1.5%～2.0%的次氯酸鈉溶液浸泡雜交種15 min，之后用無菌水清洗5次，每次2 min以上，最后將消毒后的雜交種置于裝有無菌紙的15 cm培養(yǎng)皿中備用。

1.2.2 胚拯救 消毒好的雜交種在超凈工作臺上，用鑷子挑取完整幼胚，置于裝有培養(yǎng)基的50 mL三角瓶內(nèi)進(jìn)行幼胚離體培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度28℃、空氣相對濕度70%、光照度為1 000～1 500 lx的恒溫培養(yǎng)室內(nèi)，每天光照時間為14 h。幼胚離體培養(yǎng)基為1/2 MS+植物凝膠3 g/L+NAA 0.2 mg/L。

1.2.3 組培苗煉苗及移栽 胚拯救培養(yǎng)20 d后，待幼胚離體培養(yǎng)的組培苗三葉一心約8～10 cm時，將幼苗從培養(yǎng)基上取出并在流水下小心洗去附著在幼苗根系上的培養(yǎng)基，適當(dāng)剪去過長的葉片及根系，再將幼苗放在盛有清水的50 mL三角瓶中于培養(yǎng)室內(nèi)煉苗培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為28℃、空氣相對濕度為70%、光照度為4 000～5 000 lx，每天光照14 h，5～7 d后，將幼苗移入育秧盤中，育秧盤放在溫室中，進(jìn)行常規(guī)水肥管理。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 幼胚離體培養(yǎng)2 d后胚芽及胚根陸續(xù)在培養(yǎng)基上發(fā)育生長，1周后統(tǒng)計幼胚離體培養(yǎng)效率（幼胚離體培養(yǎng)效率=綠苗數(shù)/接種的幼胚數(shù)×100%）。移栽10 d后統(tǒng)計成活率（成活率=移栽成活苗數(shù)/移栽總苗數(shù)×100%）。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生稻與栽培稻雜交及雜交胚取材時間

以栽培稻為母本、野生稻為父本，剪穎雜交后雜交子粒都能發(fā)育，但野栽雜交子粒存在胚敗育現(xiàn)象，表現(xiàn)在雜交子粒與雙親正常子粒相比，部分雜交子粒胚乳充實(shí)度與雙親相似，部分雜交子粒胚乳充實(shí)度較差，另一部分雜交子粒胚完全退化，僅剩種皮，種皮內(nèi)沒有胚乳發(fā)育。雜交子粒隨著授粉時間推移，表現(xiàn)出子粒和胚都慢慢萎縮，因此取材時間為授粉后第7天較好。授粉后第1～6天胚發(fā)育太小，不便于挑取幼胚；授粉后第8～9天子粒和胚都萎縮，亦不便于挑取幼胚。

2.2 種間雜交苗的獲得

幼胚培養(yǎng)效果見圖1，由圖1可以看出，幼胚在離體培養(yǎng)基上培養(yǎng)第2天即可看到胚芽萌動伸出培養(yǎng)基上，培養(yǎng)第3天胚芽約1～1.5 cm，同時胚根萌動，培養(yǎng)第4天時胚芽達(dá)到3 cm，胚根1 cm。之后胚芽胚根幾乎同時生長，達(dá)到一步成苗。9個組合共接種450個幼胚，共獲得發(fā)育良好健壯的綠苗438株，胚拯救率為97.3%。

圖1 胚拯救培養(yǎng)效果

2.3 組培苗煉苗及移栽

胚拯救20 d后待幼胚離體培養(yǎng)的組培苗三葉一心約8～10 cm時，按“1.2.3”進(jìn)行煉苗及移栽，移栽后常規(guī)水肥管理，注意加強(qiáng)管理，防止陽光直射及暴風(fēng)雨，移栽10 d后統(tǒng)計成活率，共移栽438株，10 d后成活434株，成活率99.1%。

圖2 組培苗煉苗

3 討論

本研究在野生稻與常規(guī)稻雜交后第7～9天進(jìn)行雜交合子胚離體培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)了授粉后盡早取胚，從而有效防止了栽培稻與長雄野生稻遠(yuǎn)緣雜種胚早衰，能使大量遠(yuǎn)緣雜交胚在離體條件下培養(yǎng)從而繼續(xù)發(fā)育成正常幼苗。而且本研究幼胚離體培養(yǎng)方法簡單、易操作，培養(yǎng)周期短、效率高，幼胚離體培養(yǎng)成苗率高達(dá)96.4%（成苗率=幼胚離體培養(yǎng)效率×成活率），提高了長雄野生稻與栽培稻遠(yuǎn)緣雜交成苗率。

本研究胚拯救獲得的F1代組培苗證明了遠(yuǎn)緣雜交的可行性，為野生稻優(yōu)良基因轉(zhuǎn)育到栽培稻中創(chuàng)制新的水稻育種材料、有效利用野生稻、進(jìn)一步挖掘和定位野生稻優(yōu)良抗性基因奠定了基礎(chǔ)。