人參愈傷誘導及其次生代謝產物的影響因素研究進展

強寶寶，韋坤華，梁瑩，韋桂麗，趙立春，繆劍華

（1.廣西藥用植物園，a.廣西藥用資源保護與遺傳改良重點實驗室；b.廣西壯族自治區中藥資源智慧創制工程研究中心，南寧 530023；2.廣西中醫藥大學，南寧 530200）

人參（Panax ginsengC.A.Mey）是五加科（Araliaceae）人參屬（Panax L.）植物，是中國傳統名貴中藥，被稱為“百藥之王”，主要分布于東三省、河北省、陜西省等地［1，2］，具有大補元氣、復脈固脫、補脾益肺、生津養血、安神益智等功效［3］。現代研究表明，人參所含的主要活性成分為人參皂苷，目前已知的人參皂苷有50多種，其中人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1是主要人參皂苷，占總人參皂苷的90%以上［4，5］。此外，人參還含有多糖、氨基酸、生物堿、黃酮等多種化學成分［6］，在抗腫瘤、抗衰老、促進生長發育、提高免疫力等方面具有很好的作用［7，8］。人參不僅作為藥材使用，還在藥膳、保健、化妝品等多個領域都有廣泛的應用［9，10］。人參栽培年限長（一般4～6年），而且生長過程中易受到許多環境因素的限制，如土壤、氣候和害蟲等［11］，對人參的品質具有較大影響。雖然野山參的質量及其人參皂苷含量都很高，但是資源缺乏［12］。

組織培養技術不受時間和地域的制約，在短時間可獲得比長期栽培植物更有價值的培養物。在人參的組織培養中，可以通過改變培養基的成分、變化培養條件、添加植物生長調節劑、添加誘導子等有效手段來促進目的產物（主要為人參皂苷）的大量產生，使人參皂苷的生產可以達到預期的結果。Lee等［13］和Murthy等［12］比較了栽培人參根、山參根和不同人參培養物中人參皂苷的積累，發現不定根培養物中（系AR-4）人參皂苷含量積累最多（32.46 mg/g），約是栽培人參根的3倍（11.35 mg/g）。Murthy等［14，15］研究發現，除皂苷Re外，人參不定根中皂苷含量均高于野生參，這些結果均表明了人參組織培養的優越性。本研究綜述了人參愈傷組織誘導研究進展，并總結了人參次生代謝產物積累的影響因素，以期為組織培養提高人參的質量和人參皂苷的產量提供參考方法和理論依據。

1 人參愈傷組織誘導研究

通過愈傷組織建立的組織培養技術不僅是植物快速繁殖的手段，也是植物遺傳改良、品種選育和提高目的產物的理想途徑。1964年，中國植物學家羅士韋教授采用人參根為外植體，成功培養獲得愈傷組織［16］。之后，美國、蘇聯、韓國等國家的研究者也相繼獲得了人參愈傷組織［17］。

1.1 不同外植體

人參不同的器官和組織對離體培養的反應是不同的，其形態發生的能力也不同。可用于誘導人參愈傷組織的外植體以根和莖最為常見。金英善等［18］表明用東北刺人參的莖段和葉柄在AS和1/2 MS培 養基上，添加2.0 mg/L 6-BA和0.2～1.0 mg/L NAA可以獲得數量較多、質量較好的愈傷組織。此后，王建華等［19，20］以人參芽孢、實生苗的根、莖、葉為外植體進行愈傷組織誘導試驗，結果表明各種不同外植體在相同誘導條件下均能誘導出愈傷組織，并確定了人參愈傷組織誘導和生長最優培養基分別為MS+2，4-D 3 mg/L+BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+KT 0.5 mg/L和MS+2，4-D 3 mg/L+KT 1 mg/L。邸雪峰等［21］研究表明，人參莖外植體誘導愈傷組織的最佳培養基為MS+2，4-D 2.57 mg/L，誘導率可達64.75%。黃景嘉等［22］以人參根切片作為外植體，在改良MS培養基中成功誘導出愈傷組織。

此外，有研究者用人參葉片誘導愈傷組織，最佳培養基為MS+7 mg/L 2，4-D和0.9 mg/L KT，誘導率可達80%以上［23］。齊海軍等［24］研究也表明，人參葉片能誘導獲得愈傷組織，最佳的誘導培養基為MS+2，4-D 2 mg/L+NAA 0.66 mg/L+KT 1 mg/L，在此培養基中接種的葉片外植體，30 d后愈傷組織誘導率為93%。而用人參成熟根誘導得到愈傷組織產生許多胚狀體，在補充有6-BA和赤霉素的培養基（1/2 MS或B5）中繼代培養得到大量的再生植株［25］。此外，Du等［26］以人參花藥進行培養誘導獲得愈傷組織，發現培養基中添加5 mg/L 2，4-D和1 mg/L KT誘導愈傷效果顯著，轉移到分化培養基中40 d后，分化成芽、根和最終的幼苗。

1.2 不同培養條件

組織培養的外在條件對人參愈傷組織的影響以溫度和光照最為顯著，常在25℃、黑暗環境中誘導人參愈傷組織。在植物生長調節劑配比方面，以2，4-D為主，并添加6-BA、KT、NAA等作為輔助調節劑。有研究者發現，人參根在24℃培養箱中暗培養，經20～30 d可形成愈傷組織，到45 d時，可見明顯的淡黃色愈傷組織［22］。蔡茁等［27］發現，廣譜植物培養基中N、P、K的配比不能完全適應人參愈傷組織的誘導。基于此，楊晶等［28］研究了人參與胡蘿卜共培養體系，發現所獲得的愈傷組織在23℃、1 000 lx的條件下生長良好，在培養基MS+2，4-D 3 mg/L+IBA 2 mg/L+KT 0.5 mg/L上培養25 d時皂苷含量達到最高，共培養物的皂苷含量比人參愈傷組織皂苷含量高6.25%。王建華等［29］研究表明，人參發根愈傷組織誘導的最佳培養基為MS+2，4-D 1 mg/L+6-BA 0.1 mg/L；人參發根愈傷組織生長的最佳培養基為MS+2，4-D 1.5 mg/L+KT 1.5 mg/L。Zhang等［30］以野生人參不定根為外植體，在MS+2，4-D 0.5 mg/L+KT 0.3 mg/L的培養基上誘導得到愈傷組織（誘導率53.3%），愈傷組織在含有0.5 mg/L 2，4-D的MS培養基上可誘導得到胚性愈傷組織和體細胞胚，體細胞胚在含有5 mg/L赤霉素的MS培養基上，85%的體細胞胚萌發；萌發的芽在1/3 SH+0.25 mg/L NAA的培養基上，可發育成具有良好主根的植物。

另外，張丹［31］研究了人參發狀根懸浮培養，得出以1/2 MS液體培養基（pH 5.8，3%蔗糖，NO3-/NH4+為2∶1，磷酸鹽濃度85 mg/L）為最佳培養基；搖床條件最適組合為接種量2.14 g，裝液量256.88 mL，溫度22.36℃，轉速134.68 r/min。在人參細胞培養中，添加0.01～1.00 mmol/L的草酸可以促進人參細胞的生長［32］。

2 組培條件對人參次生代謝產物的影響

2.1 培養基

培養基是供植物組織生長和維持的惟一養料，蔗糖是植物培養所需的主要碳源和能源，碳消耗與生物量積累以及細胞和器官的代謝狀態直接相關，培養基中所含成分對人參次生代謝產物有著直接的影響（表1）。為了改善人參細胞生長和提高皂苷的產量，Furuya等［33］研究改良MS培養基（除去NH4NO3）對5年生人參根愈傷組織懸浮培養的影響作用，在培養基提供0.5%葡萄糖和2%蔗糖時，最有利于愈傷組織的生長。在此培養條件下，與對照組相比，皂苷含量達到最大值（7.33 mg/g），并在2周后添加2%的蔗糖，能夠改善人參細胞的生長，愈傷組織干重達到最大值（17 g/L）。黃滔等［34］研究表明，隨著蔗糖濃度的升高，人參不定根干重增殖倍數呈先升高后降低的趨勢，當蔗糖濃度在40 g/L時，單位體積培養基中的多糖產量（230.45 mg/L）和皂苷產量（91.41 mg/L）均達到最大值，表明40 g/L蔗糖濃度最有利于人參不定根中的多糖和皂苷積累。

無機鹽在培養基中可調節滲透壓、pH和酶活性等，是植物生長和分化所必需的。Paek等［35］研究了MS培養基中銨與硝酸鹽的比率對人參培養物中不定根生長和人參皂苷積累的影響，表明低銨濃度和高硝酸鹽濃度有利于根系生長，在銨與硝酸鹽比率為7.19∶18.5時，不定根的生物量最大；以0 mmol/L銨與18.5 mmol/L硝酸鹽的比例實現最大人參皂苷產率（83.6 mg/L），當銨用作惟一的氮源時，根生物量和人參皂苷含量減少了1/3，所以較低濃度的銨與硝酸鹽的比例有利于人參培養。

同樣，磷元素是細胞內能量代謝的重要因子，田鵬瑋［36］以人參懸浮培養細胞為材料，通過優化培養條件對人參多糖和皂苷的積累進行了研究，結果表明適當提高培養基中的PO43-濃度可以促進多糖和皂苷的積累，最高可分別達（30.69±2.42）mg/g和（28.14±4.34）mg/g；Ca2+也是細胞生長所必需的營養元素和次級信號物質，適當提高培養基中鈣離子的濃度可以使每克干細胞中總皂苷含量增加7.92 mg。Hg2+對人參細胞中代謝產物的生長也有很大影響，當Hg2+濃度為1 μmol/L時，多糖含量達到最大值（23.52 mg/g），當Hg2+濃度為100 μmol/L時，皂苷含量達到最大值（14.82 mg/g）。

此外，Jeong等［37］以1.5 MS培養基，輔以10 mg/L IAA和75 g/L蔗糖來培養人參不定根，以期提高人參皂苷的積累，在培養10 d后，培養基補充0.75強度的MS培養基，以滿足不定根的營養需求，當培養20 d后再補充1.0強度MS培養基，使生物量增加27.45%（28.66 g/L），人參皂苷含量增加8.25%（4.92 mg/g），表明此方式顯著促進了不定根的生長和人參皂苷的合成。并且發現培養開始后20～30 d內NH4+和HPO42-離子完全耗盡，其他營養物質（K+，Cl-和SO42-）和糖的消耗量更大。此試驗結果表明，隨著培養周期的增加，初始培養基不能再滿足人參不定根生長的需求，通過培養基補充策略很好地改善了這一問題，對人參不定根中生物量的積累和人參皂苷的生物合成均具有重要促進作用。

2.2 植物生長調節劑

植物生長調節劑是影響人參生物量增長以及次生代謝產物合成的關鍵因素之一（表1）。Kim等［38］測試了4種生長調節劑2，4-D、IBA、IAA和NAA對人參的調節作用，對比發現，在含有IBA（24.6 μmol/L）的培養基中獲得了更高含量的總人參皂苷（8.09±0.30）mg/g。有研究表明，1～5 mg/L濃度范圍內的2，4-D對細胞生長至關重要，而0.1 mg/L 2，4-D有利于人參皂苷的合成［39］。在西洋參細胞懸浮培養中發現，除了單一生長調節劑的作用，不同生長調節劑的組合對細胞生長和人參皂苷積累也有很好的效果［40］，如MS+6-BA 1 mg/L+2，4-D 0.5 mg/L+NAA 1 mg/L時細胞中人參多糖含量最高（20.82±0.56）mg/g）；MS+6-BA 1.5 mg/L+2，4-D 0.5 mg/L+NAA 2 mg/L時細胞中人參總皂苷的含量最高（17.92±0.71）mg/g）［36］。在大規模培養過程中，NAA和6-BA作為生長調節劑［41］，而2，4-D僅用于愈傷組織誘導。

表1 培養基成分對人參次生代謝產物的影響

2.3 不同誘導劑

不同的激發子通過信號分子和靶基因誘導不同類型的人參皂苷，誘導方式和誘導持續時間也影響人參次生代謝產物的含量（表2）。Kim等［42-44］發現茉莉酸甲酯（MJ）的過表達增強了轉基因人參根中原人參二醇（PPD）的產生，MJ通過催化上調來自Rh2的酶，促進人參皂苷Rg3在毛狀根中積累。用MJ處理人參不定根，隨著MJ的加入，人參皂苷的產量以劑量依賴性的方式增加，150 μmol/L的MJ誘導后皂苷高達60 mg/g。于麗莉［45］對人參發狀根的皂苷合成進行研究，在培養第22 d添加MJ，當作用到培養周期的第27 d，人參發狀根皂苷含量達到最大（5.269 mg/g），MJ的最佳添加濃度為6×10-4μmol/L，同時發現，添加MJ后，刺激了發狀根代謝活動的增強，有利于次生代謝產物的合成。此外，Hu等［46］發現與MJ相比，茉莉酸-2-羥乙酯（HEJ）可以刺激三七中的人參皂苷Rb1和Rd葡萄糖基轉移酶（UGRdGT）活性升高，并表明HEJ對三七中的人參皂苷生物合成的下游調控不同，HEJ可以比MJ更有效地產生人參皂苷Rb1。

表2 誘導劑對人參次生代謝產物的影響

培養基中添加草酸可以使總皂苷含量提高5 mg/g，加甲殼素使多糖含量增加2.92 mg/g，皂苷含量增加2.32 mg/g；添加Hg2+有助于稀有皂苷C-K的積累，而添加乙二醇雙四乙酸（EGTA）增加了皂苷Rh2的積累［36］。Le等［47］用秋水仙素誘導人參不定根產生突變體，在生物反應器中，使用添加了IBA的MS液體培養基培養6周，人參皂苷產量可達186.6 mg/L，比對照組高4.85倍。

Wang等［48］將人參不定根與固定化黑曲霉孢子（ISAN）共培養24 h后，人參皂苷含量最高為（26.43±0.49）mg/g，比未處理對照（8.55±0.78）mg/g高2.09倍。因此，人參不定根與黑曲霉孢子（ISAN）共培養是提高人參皂苷產量的一種很有前景的方法，為促進植物次生代謝產物的積累提供了新的途徑。

此外，Zhang等［49］將短雙歧桿菌的α-L-鼠李糖苷酶基因過表達到毛根培養體系中，培養30 d后，人參皂苷Rg含量是對照的2.2倍，表明α-L-鼠李糖苷酶基因根提高了人參皂苷Rg1的積累，使干重最高可達3.6 mg/g。與此相同的是，Liang等［50］用吐溫80滲透到人參毛狀根中處理25 d后，發現總人參皂苷的含量增加了約3倍，表明吐溫80不僅可以作為有效的透化劑來促進毛狀根分泌人參皂苷，而且還可以作為促進人參皂苷生物合成的誘導劑。

張悅等［51，52］在人參愈傷懸浮培養生長對數期添加0.001 mg/L水楊酸，發現在培養后28 d添加水楊酸可以明顯促進人參愈傷組織中人參皂苷的合成，是對照組的130%。Zhou等［53］利用從重樓中分離出的兩種低聚糖—七糖（hs）和八糖（os），刺激人參毛狀根的生長和人參皂苷的積累，在接種10 d后分別加入30 mg/L的七糖和八糖，根系總皂苷含量從1.6%增加到3.5%以上，結果表明這兩種低聚糖在植物組織培養中可能具有植物生長調節活性。另外，Ali等［54］研究發現2.5%的CO2處理人參根45 d后，總酚、類黃酮和1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）活性分別增加了60%、30%和20%，表明酚類化合物對植物免受二氧化碳的氧化起重要作用。以上結果均表明，向人參根懸浮培養物中遞送的高濃度CO2，誘導了具有高抗氧化性質的總酚類物質的積累。因此，人參根是具有高抗氧化能力的酚類化合物的良好來源。

2.4 人參內生菌

內生菌廣泛存在于健康植物組織內部，能夠產生或促進同原植物相同或相似的活性物質，是植物微生態系統的重要組成部分，人參內生菌對人參皂苷的產生也具有調節作用（表3）。陳雪英［55］從西洋參的根部分離出3株內生細菌，證明了其中1株中含有人參皂苷Rb1，且該菌株可將皂苷Rb1部分轉化為人參皂苷Rd。之后，張薇［56］從人參根部得到2株人參內生菌——莫勒接霉（Zygorhynchus moelleri）和灰綠犁頭霉（Absidiaglauca），發現能夠將人參皂苷Rb1轉化為人參皂苷Rd。呂國忠等［57］進一步證實灰綠犁頭霉菌具有轉化底物人參皂苷Rb1制備Rd的能力。另外，侯耀達等［58］從7年生林下參根部分離得到1株霉菌GS1-33，能有效地將人參根總皂苷轉化為人參稀有皂苷C-K及Rh1。此外，陳泠［59］考察3R-2菌絲對人參毛狀根生長和次生代謝成分生物合成的影響，研究表明在3R-2菌絲與人參毛狀根共培養的14～21 d內有顯著的促進作用；培養14d時，人參皂苷Rc的含量達到最高。

表3 人參內生菌對次生代謝產物的影響作用

2.5 其他

目前，除了以上所述的影響條件，在促進人參產生更多次生代謝產物的影響因素方面，還發現幾種比較新的方法和誘導條件（表4）。Kim等［60］研究人參-西洋參雜交體（PGQ），發現其生長旺盛且它的根比親本的大，對PGQ及其親本的體細胞胚胎發生（SE）進行了比較研究，PGQ外植體的胚胎誘導率較高（2 mg/L 2，4-D作用下胚胎誘導率約56%），其發芽胚在土壤轉移后都產生新的芽，在親本中發現了種間雜交人參，F1雜交體（PGQ）含有2個種特異性人參皂苷（人參皂苷Rf和西洋參假人參皂苷F11），其他人參皂苷含量均高于親本。

表4 其他作用方式對人參次生代謝產物的影響

張磊等［61］研究NO供體硝普鈉（SNP）在光照脅迫下對人參愈傷組織細胞生長及次生代謝產物積累的影響，發現在光照脅迫下，SNP處理后人參愈傷組織中抗氧化酶活性得到增強，清除了強光脅迫下產生的活性氧，緩解了強光對人參愈傷組織的脅迫作用，并發現NO可促進萜類物質的合成，并可促進細胞合成纖維素、木質素、多糖和皂苷的積累。

Le等［62］用伽馬射線照射不定根培養物，產生了4個獨特的突變株，發現突變系的人參皂苷含量比對照組的高4.2倍。伽馬射線處理的不定根突變株代表了人參皂苷商業化生產的良好方式。Lee等［63］用根霉屬真菌Rhizopus oligosporus發酵野生人參14 d后，總皂苷含量從3 274 mg/kg增加到5 573 mg/kg。

3 小結與展望

目前，關于人參組織培養技術的研究已經日趨完善，在中國、日本和韓國已經實現了人參組織培養的工業化生產。在人參愈傷組織誘導方面，以人參根、莖、葉誘導最為常見，其中，莖和葉誘導效果比較明顯，誘導率比較高，因此，使用人參莖和葉誘導愈傷組織已被廣泛采用。人參愈傷誘導大多使用MS培養基，添加2，4-D作為愈傷組織主要誘導調節劑，并添加6-BA、KT、NAA等作為輔助調節劑。

人參皂苷是人參合成的重要代謝產物。在組織培養中，人參的次生代謝產物受培養基、生長素、誘導劑以及人參內生菌等多種因素的影響，研究者們常利用此類因素的影響作用以達到促進人參皂苷積累的目的。因此，深入地研究組培條件對人參次生代謝產物的影響作用，才能最大化地提高人參組培物的質量和產量。隨著科技的進步和相關研究的發展，提高人參皂苷的研究必將成為熱點，未來將產生巨大的科學價值和經濟效益。