關節表層軟骨干細胞在骨關節炎中的作用研究進展

徐偉，廖冬發，夏寧，劉達，王維，鄭偉

西部戰區總醫院骨科，成都 610083

關節表面覆蓋著含水豐富、無神經和血管分布的關節軟骨，其由表層、中間層、深層和鈣化軟骨層構成。關節軟骨表層(superficial zone，SPZ)由2～4層扁而長的細胞沿關節面平行排列而成，其中平行分布的膠原纖維及表層細胞分泌的潤滑素[由蛋白聚糖4(proteoglycan 4，Prg4)基因編碼]可減小關節活動中的摩擦力，維持關節軟骨的完整性和功能[1]。中間層和深層中存在的唯一類型的細胞是關節軟骨細胞，其與關節表面呈垂直分布并分泌大量蛋白聚糖和網狀分布的Ⅱ型膠原纖維，可以保留大量水分，增加關節軟骨的韌性和彈性并可吸收及緩沖應力。鈣化層軟骨細胞肥大化，可分泌Ⅹ型膠原纖維，通過鈣化基質將應力均勻傳遞到軟骨下骨中[2-3]。

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是一種以軟骨細胞肥大和凋亡、軟骨細胞外基質降解、滑膜炎性浸潤以及軟骨下骨重塑為主要病理特征的慢性致殘性疾病[3-4]。OA早期的病理變化主要為關節SPZ的組織纖維化和組織完整性破壞。關節SPZ細胞也是第一個隨著年齡增長而丟失的細胞，與30歲比較，85歲丟失的SPZ細胞多達50%[5]。目前尚無有效方法延緩OA進展，OA患者最終只能進行關節置換。由于目前治療方法的局限性，激發了研究者對采用干細胞再生軟骨進而治療OA的廣泛興趣[6-7]。大多數干細胞治療研究都是采用體外貼壁擴增的間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，后者主要來源于骨髓或脂肪組織，但這些MSCs在關節軟骨再生中的效果仍存在爭議，其產生的軟骨樣組織與正常關節軟骨在生物特性和功能上具有一定差距[8]。理想的關節軟骨修復不僅是新生軟骨填充軟骨缺損部位，且新生的軟骨應具有與原關節軟骨相同的分層結構、生物特性及基質組分，以達到更為完美的功能學修復[9]。為解決該問題，有研究者提出激活動員關節軟骨內源性干細胞的方法以促進缺損部位進行自我修復[10-11]。雖然關節軟骨缺乏自我修復能力，但大量研究證實關節SPZ中存在軟骨干細胞(cartilage-derived stem/progenitor cells，CSPCs)，本文對關節表層軟骨干細胞(SPZ-CSPCs)及其在OA中的作用研究進展作一綜述。

1 SPZ-CSPCs的發現簡史及特異性標志物

盡管缺乏自我修復能力，但已證實關節軟骨中存在一批具有干細胞特性的細胞。這些軟骨來源的具有干細胞特性的細胞已在人、馬和牛等的關節軟骨中被發現，并依據其具備自我更新能力、干細胞相關表面標志物和多項分化潛能而被分離和鑒定[12]。Hayes等[13]發現，軟骨細胞可能是從關節SPZ開始更新(稱為外加生長)，而不是從深層軟骨開始更新(間質生長)。Candela等[14]利用溴脫氧尿苷(bromodeoxyuridine，BrdU)長時程標記實驗發現，小鼠關節SPZ中存在一群BrdU標記保留細胞，而BrdU標記保留是成體干細胞的特征之一。譚喬燕等[15]分離小鼠關節SPZ細胞并進行功能鑒定，發現SPZ細胞具有體外克隆形成能力和三系分化能力，且可表達MSCs表面標志物，表明SPZ細胞具有干細胞特性。同樣，有學者在人關節SPZ中也發現了“干細胞樣”細胞[12]。這些細胞的共同特點是表達特異性MSCs相關表面標志物，包括CD105、血管細胞黏附蛋白-1(vascular cell adhesion molecules-1，VCAM-1，也稱CD106)、CD166、NOTCH-1、STRO-1和平滑肌肌動蛋白(smooth muscle actin，SMA)等。Lotz等[16]報道，在正常關節SPZ細胞中，NOTCH-1、STRO-1和VCAM-1陽性細胞占比高達45%。盡管上述研究證實了關節SPZ中“干細胞樣”細胞的存在，且具有類似于MSCs的干細胞特性，包括自我更新能力、多向分化潛能和表達MSC相關表面標志物，但由于研究手段有限，這些研究并未提出可在體內進行可靠鑒定和譜系示蹤的SPZ-CSPCs特異性標志物，即無直接證據證實SPZCSPCs的存在。這些從關節SPZ中分離和鑒定的干細胞只能稱為軟骨“干細胞樣”細胞。

隨著細胞示蹤技術和基因技術的發展，近年來多項研究為SPZ-CSPCs的存在提供了直接證據。Kozhemyakina等[17]將CreERT2表達盒(一種他莫昔芬誘導的Cre等位基因)敲入小鼠Prg4基因中，利用該小鼠品系進行細胞示蹤，發現PRG4蛋白特異性地表達于SPZ細胞和滑膜襯里細胞中，PRG4+細胞是存在于關節SPZ中的CSPCs，其一方面通過對稱分裂維持自身干細胞數量，另一方面通過不對稱分裂向下分化為中層和深層的軟骨細胞。Li等[5]進一步證實了該研究結果，發現PRG4+細胞同時參與幼年小鼠關節軟骨的外加生長和間質生長，并能完全重建成年關節軟骨組織。此外，SPZ中PRG4+細胞分裂緩慢，具有自我更新能力，并表達干細胞特異性標志物，符合成體干細胞的標準，是一種SPZ-CSPCs。Decker等[18]進一步采用兩種替代的、獨立衍生的小鼠品系(Prg4-CreERT2小鼠和Dkk3-CreERT2小鼠)證實了上述結論。這3項研究為SPZCSPCs的存在提供了直接證據，表明SPZ-CSPCs在出生后即存在于關節SPZ中，PRG4為其干細胞特異性標志物。

2 SPZ-CSPCs對關節發育和穩態維持的作用

關節發育是一個復雜而有序的過程，在小鼠胚胎期10.5 d，MSCs凝聚形成軟骨雛形，隨后在將來關節形成的部位出現扁平狀的MSCs并形成中間帶，中間帶的出現是關節發育的第一征象。隨后，中間帶中分化出現關節腔，中間帶及其周圍的細胞逐漸形成關節軟骨和滑膜關節[19]。關節發育過程受多種信號通路和分子的調節，包括生長分化因子5(growth differentiation factor 5，GDF5)、Wnt、印度豪豬蛋白(indian hedgehog，IHH)、甲狀旁腺激素相關蛋白(parathyroid hormone related protein，PTHrP)、骨形態生成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)和成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)等[19]。既往研究發現，在胚胎發育早期，所有關節結構都來源于中間帶的GDF5+干細胞[20]。近期通過對關節形成的時空特征進行研究提出了流入模型，即在關節形成過程中外周細胞不斷流入中間帶的GDF5+干細胞區域，同時GDF5+干細胞從中間帶流向骨骺軟骨[21]。因此，新的軟骨干細胞不斷從外周組織中得到補充，而同時GDF5+干細胞也不斷向外周流出，進一步促進胎兒期骨骺軟骨的生長。出生后當關節完全形成時，GDF5+干細胞消失，PRG4+干細胞出現。GDF5+干細胞在胚胎期14.5～15.5 d開始局限于SPZ，隨后在胚胎期15.5 d至出生前消失，與此同時，關節SPZ細胞開始表達PRG4，這些GDF5+干細胞可能轉變成了PRG4+干細胞[5,20-21]。

出生后，PRG4+干細胞分裂非常緩慢，其通過對稱分裂進行自我更新，兩個子細胞都停留在SPZ中成為SPZ-CSPCs。與此同時，關節SPZ中PRG4+干細胞通過不對稱分裂，部分細胞分化成為軟骨細胞。當發育成熟后，所有關節軟骨細胞都來源于SPZ中的PRG4+干細胞[5,17]。Kozhemyakina等[17]在胚胎期17.5 d對PRG4+干細胞進行標記示蹤，發現其后代細胞構成了成年小鼠關節軟骨的所有層(從表層至鈣化層)，即使在1月齡時開始標記示蹤，PRG4+干細胞也會在1年內緩慢擴張到潮汐線以上的整個軟骨層?？傊?，SPZ中的PRG4+干細胞是具備自我更新能力的SPZ-CSPCs，這些細胞負責成年小鼠軟骨的形成和穩態維持(圖1A、B)。

3 SPZ-CSPCs對軟骨再生和OA的作用

早期研究雖然缺乏用于體內直接示蹤SPZCSPCs的干細胞特異性標志物，但多項研究提示這些SPZ“干細胞樣”細胞在軟骨損傷和OA中發揮了重要作用。Seol等[22]首先報道了健康軟骨組織中因鈍性機械損傷而遷移出現軟骨“干細胞樣”細胞，這些軟骨“干細胞樣”細胞會對軟骨損傷伴隨的生物變化(如細胞外基質降解、血管浸潤和滑膜炎癥)做出反應。Seol等[23]發現，細胞外基質降解酶對軟骨細胞外基質的損傷促進了體外培養的關節軟骨組織中軟骨“干細胞樣”細胞的遷移。軟骨損傷后釋放的炎性因子如高遷移率族蛋白-1(high mobility group box-1，HMGB-1)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)和血小板源性生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)等促進了軟骨“干細胞樣”細胞的遷移[12]。

多項研究表明，SPZ中“干細胞樣”細胞參與了OA的各個階段。OA組織中細胞增殖和干細胞表面標志物增多，如CD105+、CD166+細胞在OA軟骨中的比例約為8%，而在正常軟骨中的比例約為4%，提示這些軟骨“干細胞樣”細胞可能參與了OA的發病過程[24]。在OA早期，關節軟骨的裂隙及其周圍出現增殖的細胞群，這些細胞群中大多數細胞表達干細胞特異性標志物，如NOTCH-1、STRO-1和VCAM-1等[16,25]。在OA晚期，Koelling等[26]發現，在退變軟骨部位出現軟骨“干細胞樣”細胞的遷移群體，這些細胞可能是從損傷局部細胞直接增殖而來和(或)從鄰近組織(滑膜、軟骨下骨、關節液等)遷移而來的。

隨著研究技術的發展和SPZ-CSPCs特異性標志物的發現，SPZ-CSPCs在關節軟骨再生和OA中的作用獲得了直接證據。Decker等[18]發現，關節軟骨損傷后7 d，軟骨缺損區域的細胞主要由PRG4+細胞的后代構成(≤70%)。值得注意的是，Decker等[18]觀察到，PRG4+細胞在關節滑膜中大量增殖，而在軟骨SPZ區域，PRG4+細胞及其子代均不增殖。此外，軟骨損傷部位與增生的滑膜組織距離越近，PRG4+示蹤細胞在缺損區域所占的比例越大，表明位于滑膜的PRG4+細胞而不是SPZ的PRG4+細胞參與了軟骨損傷的修復過程[18]。Roelofs等[27]進一步研究發現，軟骨損傷后，參與再生修復的細胞絕大部分為GDF5+細胞(≤80%)，這一比例與PRG4+子代細胞在軟骨損傷修復中的比例相當。此外，GDF5+滑膜細胞也表達PRG4，表明GDF5+細胞可能是出生前PRG4+細胞的祖細胞，而PRG4+細胞則是出生后的CSPCs[28]。值得注意是，Roelofs等[27]發現，軟骨急性損傷后滑膜中GDF5+細胞大量增殖，但臨近損傷部位的SPZ-CSPCs卻幾乎沒有反應。由于PRG4+細胞和GDF5+細胞同時存在于滑膜和SPZ中，因此參與軟骨損傷修復的CSPCs究竟來源于滑膜還是SPZ需要進一步探討。相反，Seol等[22]在關節軟骨組織體外培養損傷模型中發現，SPZ中的“干細胞樣”細胞可以遷移到軟骨組織的損傷部位，由于這種干細胞遷移在體內細胞示蹤實驗中不易發現，因此，不能完全排除SPZ中PRG4+干細胞對軟骨損傷的修復作用。同時，Roelofs等[27]發現，損傷部位參與軟骨再生修復的細胞中有一部分細胞不屬于標記示蹤的細胞，提示除PRG4+干細胞外，可能存在其他特異性標志的干細胞參與了軟骨損傷修復過程(圖1C)。

圖1 SPZ-CSPCs對關節發育和軟骨損傷的修復作用Fig.1 Effects of SPZ-CSPCs in joint development and repair of cartilage injury

Tan等[29]研究發現，特異性敲除小鼠SP ZCSPCs中活化素受體樣蛋白激酶5(activin receptorlike kinase 5，Alk5)基因后，SPZ中PRG4+干細胞數量減少，表面潤滑素分泌減少，并伴有軟骨退變加快和OA的發生，提示PRG4+干細胞在OA中發揮著重要作用。相反，Zhang等[30]發現，通過誘導白喉毒素的自主表達來殺死小鼠關節SPZ中的PRG4+干細胞后，并不會導致軟骨退變加快和OA的發生。該研究結果似乎與SPZ-CSPCs在關節穩態維持和OA中的重要作用相矛盾。雖然大量的PRG4+軟骨干細胞死亡，但有證據表明，幸存的SPZ-CSPCs會以更快的速度進行增殖分裂，最終重新補充原來SPZCSPCs耗盡的區域。同時，由于白喉毒素誘導的細胞死亡不會對關節軟骨造成機械損傷，這種方法可能不足以激發SPZ-CSPCs的軟骨再生修復反應[5]。

4 調控SPZ-CSPCs的功能對OA的作用

關節發育和穩態維持過程受多種信號通路和分子的調節，包括GDF5、Wnt、IHH、PTHrP、BMP、TGF-β和FGF等[19]，同樣多種信號通路和分子可調控SPZ-CSPCs的功能進而影響OA的發生和發展，包括Wnt/β-catenin、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、TGF-β和PRG4等。Koyama等[20]發現，β-catenin條件性敲除(conditional knockout，CKO)小鼠(Col2a1-β-catenin CKO或Gdf5-β-catenin CKO)關節SPZ中扁平狀細胞(主要是SPZ-CSPCs)消失且潤滑素表達減少。Yasuhara等[31]發現，條件性敲除β-catenin的小鼠關節軟骨中SPZ細胞和潤滑素表達減少，同時關節軟骨分層結構消失，均由圓形的軟骨樣細胞組成。Xuan等[32]發現，SPZ-CSPCs特異性β-catenin敲除小鼠的OA進展較野生小鼠明顯加快，并伴有SFZ破壞。相反，SPZ-CSPCs特異性β-catenin增強小鼠的潤滑素表達增加，OA進展較野生小鼠明顯減慢。上述研究結果表明，經典的Wnt/β-catenin信號可通過誘導SPZ-CSPCs分泌潤滑素而在關節軟骨穩態維持和OA中發揮重要作用。Jia等[33]發現，軟骨特異性EGFR敲除小鼠的關節軟骨中SPZ細胞數量明顯減少，潤滑素分泌減少，同時關節軟骨退變加快。Wei等[34]發現，軟骨特異性EGFR過表達小鼠的SPZ-CSPCs數量增加、增殖加快，潤滑素分泌增多，內側半月板不穩定(destabilization of the medial meniscus，DMM)誘導的軟骨退變減慢。TGF-β信號通路在關節軟骨發育、穩態維持及OA的發生中也具有重要作用。近期研究發現，TGF-β信號通過調控SPZ-CSPCs的功能在OA中發揮重要作用。王權[9]和Tan等[29]發現，SPZ-CSPCs中特異性敲除Alk5基因抑制TGF-β/ALK5信號后，在老年性OA或DMM誘導的OA模型中，SPZ-CSPCs數量減少，潤滑素分泌減少，并伴有軟骨退變加快。進一步研究發現，Alk5 CKO小鼠中SPZ-CSPCs表現出衰老表型，包括SPZ-CSPCs增殖和分化減少、SA-β-gal陽性細胞增多、ROS產生增加、線粒體明顯腫脹以及溶酶體破裂[29]。潤滑素特異性表達于SPZ-CSPCs中，人類和小鼠中Prg4基因缺失可導致關節軟骨退變加快及OA的發生[35]。Zhang等[36]發現，Creb5是一種特異性表達于SPZ細胞中的轉錄因子，是TGF-β和EGFR信號誘導潤滑素表達所必需的。Delve等[37]發現，在SPZ細胞中，Yes相關蛋白(Yes-associated protein，YAP)和PDZ結合基序轉錄共激活因子(transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ)可調控潤滑素的表達。

5 總結與展望

綜上所述，至少有一種類型的SPZ-CSPCs(PRG4+細胞)已在小鼠中被發現和鑒定，且PRG4+干細胞很可能是GDF5+細胞的后代。PRG4+干細胞同時存在于SPZ和滑膜中，存在于SPZ中的PRG4+干細胞在出生后分化成軟骨細胞，形成完整的關節軟骨。PRG4+干細胞在軟骨損傷后可遷移到軟骨損傷部位，但這些干細胞的來源(滑膜還是SPZ)及其在軟骨損傷修復中的愈合潛力仍待進一步闡明(圖1)。SPZ-CSPCs在OA的發生和發展中發揮著重要作用，多種信號通路和分子(如Wnt/β-catenin、EGFR、TGF-β和PRG4等)通過調控SPZ-CSPCs的功能而影響OA的發生和發展。雖然激活動員內源性SPZ-CSPCs或局部注射外源性SPZ-CSPCs來促進缺損部位修復為OA的治療帶來了曙光，但其只適用于較小面積的損傷修復，關節軟骨大面積缺損需借助組織工程技術進行移植重建，同時外源性干細胞治療存在靶向性差、半衰期短等問題，需要與組織工程技術結合使用。未來SPZ-CSPCs有望作為組織工程種子細胞被應用于軟骨組織工程，移植重建創傷或OA引起的關節軟骨缺損。