尋常型銀屑病皮損組織中chemerin、Sprouty1的表達與病情嚴重程度的相關性分析

袁波，宋丹丹，吳燕，俞鶯，譚城

1無錫市第五人民醫院皮膚性病科，江蘇無錫 214011；2江南大學附屬醫院皮膚性病科，江蘇無錫 214000；3江蘇大學醫學院生理學教研室，江蘇鎮江 212013；4江蘇省中醫院皮膚科，南京 210029

尋常型銀屑病是一種易復發的慢性免疫炎癥性皮膚病，臨床主要表現為紅色丘疹、斑塊，可發生于全身，最常見于四肢伸側和骶尾部，具有家族遺傳傾向，常伴發代謝綜合征[1]，其確切病因目前尚未明確，可能與遺傳、免疫因素有關[2]。研究發現，肥胖是最易促發或加重銀屑病的因素之一，二者在基因水平上存在關聯[3]。脂肪因子chemerin是肥胖相關炎癥的生物標志物，屬于多功能性蛋白質，在免疫細胞趨化、脂肪細胞代謝及血糖穩態過程中起著重要作用[4]。有研究發現，chemerin在銀屑病患者血清中異常表達[5]。尋常型銀屑病患者表皮角質形成細胞的增殖分化異常，而Sprouty1與肌肉干細胞的增殖、分化有關，可能是角質形成細胞的負反饋調節因子[6]。目前關于銀屑病患者血清中chemerin的研究較多，但其皮損組織中chemerin、Sprouty1的相關研究較少。本研究旨在分析尋常型銀屑病患者皮損組織中chemerin、Sprouty1的表達與銀屑病皮損面積和嚴重程度指數(psoriasis area and severity index，PASI)的相關性，以期為尋常型銀屑病的發病機制和治療研究提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018年2月－2020年11月于無錫市第五人民醫院和江南大學附屬醫院皮膚性病科門診接受治療的68例尋常型銀屑病患者作為實驗組。納入標準：(1)符合《中國銀屑病診療指南(2018完整版)》[7]的診斷標準；(2)年齡22～61歲；(3)自愿參與本研究；(4)近1個月未使用免疫抑制劑和糖皮質激素。排除標準：(1)心、腦、肝、腎等器官功能嚴重障礙者；(2)合并其他皮膚疾病者；(3)合并類風濕關節炎、干燥綜合征、系統性硬化、肌炎、強直性脊柱炎、銀屑病關節炎、痛風等其他免疫性疾病者。以同期在兩院體檢的68名健康者作為對照組。本研究符合《赫爾辛基宣言》相關準則，通過無錫市第五人民醫院和江南大學附屬醫院倫理委員會審批(JNDXFSYYLL 2018-006)，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器 免疫組化試劑盒購自上海莼試生物技術有限公司；二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒購自上?；蚩萍加邢薰荆籘rizol試劑購自武漢普諾賽生命科技有限公司；chemerin抗體、Sprouty1抗體、內參3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)試劑盒購自英國Abcam公司；反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒、Western blotting檢測試劑盒購自上海吉瑪制藥技術有限公司。XHC-SV1型顯微鏡購自北京東方華測科學技術中心；LWD300-38LFT型無窮遠倒置熒光顯微鏡購自西安測維光電技術有限公司；紫外分光光度計購自北京友儀四方科技發展有限公司。

1.2.2 標本采集與處理 采集尋常型銀屑病患者軀干或四肢的皮損組織及健康者的正常皮膚組織各1.0 cm×0.5 cm×1.5 cm，分成3份，1份采用10%多聚甲醛溶液固定，脫水、石蠟包埋、切片(厚4 μm)，行免疫組化檢測，余2份分別于–80 ℃液氮中保存，行Western blotting和RT-PCR檢測。

1.2.3 免疫組化檢測皮膚組織中c h e m e r i n、Sprouty1蛋白的表達情況 將切片脫蠟水化，室溫下滴加3% H2O2溶液，避光孵育10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min×3次，分別滴加chemerin抗體(1:200)、Sprouty1抗體(1:100)，4 ℃孵育16 h；加入生物素標記的二抗(1:100)，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3 min×3次；滴加辣根標記液，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3 min×3次；DAB顯色40 s，蘇木精復染2 min，95%乙醇置換去水，中性樹膠封片，鏡檢，拍照觀察chemerin、Sprouty1的表達情況。

1.2.4 Western blotting檢測皮膚組織中chemerin、Sprouty1蛋白相對表達量 提取皮損組織和正常皮膚組織蛋白，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離，將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，用10 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH為8.3)洗滌，分別加入兔抗chemerin(1:100)、Sprouty1(1:100)、GAPDH(1:100)一抗過夜，Tris-HCL緩沖液洗滌；加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)二抗(1:200)，2 h后洗膜，增強型化學發光試劑(ECL)底物顯影后，利用分子成像系統分析條帶灰度值，以目的條帶灰度值與內參GAPDH灰度值的比值表示蛋白相對表達量。

1.2.5 RT-PCR檢測皮膚組織中chemerin、Sprouty1 mRNA相對表達量 將凍存組織研磨后用Trizol試劑提取總R N A，紫外分光光度計測定其濃度、純度及完整性。參照RT-PCR試劑盒說明書步驟擴增cDNA，擴增條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，60 ℃延伸1 min，共40個循環；循環結束后60 ℃延伸5 min，4 ℃保存。每個樣品的Ct值以β-actin作為內參進行校正，采用2–ΔΔCt法計算chemerin、Sprouty1 mRNA相對表達量。引物序列來自Sanger數據庫，由上海賽百勝基因技術有限公司合成。Chemerin引物：正義5'-CCCGGCTTCAGGATTTAC-3'，反義3'-GCTGGACCATGACTGAGTTG-5'；Sprouty1引物：正義5'-ATGGATCCCCAAGGTCAACA-3'，反義3'-CGAGGAGCAGGTCTTCCCAC-5'；β-actin引物：正義5'-AAGTATGACAACAGCCTCAAG-3'，反義3'-TCCACGATACCAAAGTTGTC-5'。

1.3 病情評估 采用PASI[8]對患者病情進行評估。由同一專家分別對患者的紅斑(E)、鱗屑(D)、浸潤(I)程度和皮疹面積進行記錄，并計算PASI值。PASI評分(h)=0.1×(Eh+Dh+Ih)評分×A；PASI評分(u)=0.2×(Eu+Du+Iu)評分×A；PASI評分(t)=0.3×(Et+Dt+It)評分×A；PASI評分(i)=0.4×(Ei+Di+Ii)評分×A；PASI總分=PASI評分(h)+PASI評分(u)+PASI評分(t)+PASI評分(i)。其中h、u、t、i分別代表頭部、上肢、軀干、下肢，A表示皮損面積。

1.4 統計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。計量資料以表示，組間比較采用配對t檢驗；計數資料以例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Pearson相關分析法進行相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組一般資料比較 實驗組男39例，女29例，年齡25～61歲；對照組男35例，女33例，年齡22～57歲。兩組性別、年齡、體重指數等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05，表1)。

表1 兩組尋常型銀屑病患者一般資料比較Tab.1 Comparison of general information between psoriasis vulgaris patients of the two groups

2.2 尋常型銀屑病患者的臨床表現 68例尋常型銀屑病患者中，37例(54.4%，37/68)皮損發生在上肢，其中19例(51.4%，19/37)累及頭皮；余31例(45.6%，31/68)皮損發生在下肢，其中24例(77.4%，24/31)累及背部，皮損大小不一，以紅色斑塊、結節為主，上層覆蓋厚層銀白色鱗屑。

2.3 兩組皮膚組織中chemerin、Sprouty1蛋白表達情況 免疫組化檢測結果顯示，兩組皮膚組織中均有chemerin、Sprouty1蛋白表達。Chemerin蛋白在實驗組皮損脂肪組織中呈高表達，在對照組皮下脂肪組織中少量表達；Sprouty1蛋白在實驗組皮損顆粒層細胞的細胞膜中少量表達，在對照組表皮全層細胞的細胞膜和細胞質中呈高表達(圖1)。

圖1 兩組皮膚組織中chemerin、Sprouty1蛋白表達情況(免疫組化×200)Fig.1 Expressions of chemerin and Sprouty1 proteins in skin tissues of the two groups (Immunohistochemistry ×200)

2.4 兩組皮膚組織中chemerin、Sprouty1 mRNA和蛋白相對表達量比較 RT-PCR和Western blotting檢測結果顯示，實驗組皮膚組織中chemerin mRNA (1.478±0.14vs. 0.858±0.08，P<0.001)和蛋白(1.138±0.12vs.0.789±0.06，P<0.001)相對表達量明顯高于對照組，Sprouty1 mRNA(0.837±0.04vs. 1.346±0.09，P<0.001)和蛋白(0.646±0.05vs. 1.212±0.12，P<0.001)相對表達量明顯低于對照組(圖2)。

圖2 兩組皮膚組織中chemerin、Sprouty1蛋白表達情況(Western blotting)Fig.2 Expressions of chemerin and Sprouty1 proteins in skin tissues of the two groups (Western blotting)

2.5 皮損組織中chemerin、Sprouty1蛋白相對表達量與PASI評分的相關性 Pearson相關分析結果顯示，68例尋常型銀屑病患者皮損組織中chemerin蛋白相對表達量與PASI評分呈正相關(r=0.536，P<0.05)，Sprouty1蛋白相對表達量與PASI評分呈負相關(r=–0.619，P<0.05，圖3)。

圖3 尋常型銀屑病患者皮損組織中chemerin、Sprouty1蛋白相對表達量與PASI評分的相關性Fig.3 Correlation of the relative expression of chemerin and Sprouty1 protein in skin lesions to PASI score

3 討 論

尋常型銀屑病是銀屑病最常見的類型之一，易伴發多種代謝性疾病，可能與患者的不良生活方式及疾病本身的多種因素有關。尋常型銀屑病與代謝性疾病存在共同的危險因素和發病機制，其中肥胖是代謝綜合征發生的源頭，多項研究顯示，尋常型銀屑病患者的肥胖率高于普通人群，且PASI評分與體重指數呈正相關，而肥胖常伴隨著脂肪的堆積，可增加炎性脂肪細胞因子的分泌，引起胰島素抵抗及相關并發癥[9]。

Chemerin是脂肪因子家族的新成員，在人脂肪組織中呈高表達，具有趨化白細胞的功能，可募集表達chemerin受體的炎性細胞，參與代謝綜合征及相關疾病的病理生理過程[10]。研究發現，肥胖人群血清chemerin水平與白細胞介素-6(IL-6)等炎性因子關系密切，且可影響與銀屑病發病相關的樹突細胞、單核細胞、巨噬細胞等固有免疫效應細胞，被認為是銀屑病早期病變的標志物[11]。楊雪松等[12]分析了尋常型銀屑病患者血清chemerin水平與PASI評分的相關性，發現PASI評分與血清chemerin水平存在正相關關系。本研究結果顯示，銀屑病患者皮損組織與健康對照皮膚組織中均有chemerin的表達，但銀屑病患者皮損組織中chemerin蛋白和mRNA相對表達量均高于對照組，且chemerin蛋白相對表達量與PASI評分呈正相關，與余澤瑩等[13]的研究結果相似，提示chemerin蛋白可能參與了尋常型銀屑病發病機制中的免疫應答及表皮異常增殖。

研究顯示，銀屑病是由角質形成細胞與浸潤免疫細胞之間的相互作用引起的，但影響角質形成細胞增殖的因素及其與銀屑病發病機制的關系仍不明確[14]。Sprouty1蛋白是MAPK信號通路的負性調節蛋白，可負性調節生長因子誘導的細胞增殖、分化、運動和存活[15]。Weng等[16]發現，銀屑病患者皮損處MAPK活性明顯升高，被激活的MAPK發生磷酸化，可在表皮中促進細胞生長和增殖，并調節免疫應答，從而參與銀屑病的發生和發展。本研究結果顯示，銀屑病患者皮損組織與健康對照皮膚組織中均有Sprouty1的表達，但銀屑病患者皮損組織中Sprouty1蛋白和mRNA相對表達量低于對照組，且Sprouty1蛋白相對表達量與PASI評分呈負相關，與李錦意等[17]的研究結果基本一致，提示Sprouty1蛋白在角質形成細胞與銀屑病發病機制中發揮作用，但仍需進一步研究證實。

綜上所述，尋常型銀屑病皮損組織中chemerin、Sprouty1蛋白異常表達，其相對表達量與PASI評分存在相關性，該結果為開展尋常型銀屑病的通路和靶向治療研究提供了理論基礎，但后續仍需進一步探究chemerin及Sprouty1蛋白在銀屑病皮損組織中發揮調控作用的具體機制，以期為銀屑病的治療提供新的方向。