lncRNA-ATB、miR-34a和miR-145在高齡肺腺癌患者癌組織中的表達水平及臨床價值

袁 旦，邰 萍

江蘇省南京市第一醫院檢驗科，江蘇南京 210000

肺癌作為目前發病率最高的一種惡性腫瘤，是造成癌癥病死率居高不下的重要原因，且發病率呈逐年上升趨勢，大部分發病人群為中老年患者，肺腺癌是非小細胞肺癌的常見類型之一。近年來，微創外科技術在惡性腫瘤的治療中得到廣泛應用和發展，已經成為肺腺癌的重要治療手段，但患者術后預后評價指標仍需要進一步探索[1]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一種不具備蛋白質編碼功能的RNA，一般由200個以上核苷酸組成?，F有研究證實，人體95%左右的RNA是不編碼功能蛋白的，但很大一部分lncRNA在基因表達調控中發揮重要作用，其可以作為基因調控的一種上游分子，能夠從轉錄及轉錄后調控、表觀遺傳學等方面調節基因表達過程[2]。微小RNA(miRNA)是生物體內廣泛存在的一類內源性且高度保守的非編碼單鏈RNA，可以參與生物體細胞的增殖、分化、凋亡、免疫、代謝及炎性反應等重要生理過程[3]。miR-34a是一類具有顯著抑癌作用的高度保守miRNA，可通過與相關癌基因結合使得癌細胞周期G1期發生停滯，從而抑制癌細胞的增長并促使其凋亡。miR-145是位于人體5號染色體的另一種miRNA，可通過有效調控下游靶基因表達情況抑制腫瘤細胞增殖、分化，且在乳腺癌、肺癌、腸癌等多種惡性腫瘤中發揮重要作用[4]。本研究通過檢測肺腺癌患者癌組織中被轉化生長因子β激活的長鏈非編碼RNA(lncRNA-ATB)、miR-34a和miR-145表達水平并探討其與患者預后之間的關系，以期為臨床提供依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年8月至2016年8月在本院治療的112例高齡肺腺癌患者為研究對象，患者年齡70～85歲，平均(76.41±2.68)歲，其中男64例，女48例，吸煙和非吸煙患者各55、57例，TNM分期為Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期的患者分別為57、50、5例。納入標準[5]：(1)所有患者經組織病理檢查確診為肺腺癌；(2)患者年齡不低于70周歲；(3)患者未發生淋巴結轉移；(4)患者入組前未接受過其他胸部手術或化療；(5)患者無放療禁忌證且可以耐受手術。排除標準：(1)心、肝、腎功能嚴重異常者；(2)術前經過新輔助化療者；(3)合并有嚴重感染、凝血功能障礙等疾病者；(4)無法完成隨訪者。本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1臨床資料收集 收集并記錄入選患者入院時的年齡、性別、TNM分期、病理分級以及影像學檢查等臨床資料，并以總生存率(OS)作為肺腺癌患者術后生存情況的評價指標。

1.2.2lncRNA-ATB、miR-34a和miR-145表達水平測定 手術過程中獲得所有患者癌組織和癌旁組織，并立刻置于-80 °C液氮中保存；統一取出癌組織和癌旁組織并加入TRIzol試劑(Invitrogen 公司)將細胞完全裂解，并于室溫條件下靜置5 min，然后加入氯仿200 μL于裂解后細胞中，渦旋20 s后再于室溫條件下靜置5 min。取靜置后樣品放入離心機中，在12 000 r/min條件下離心15 min，將上清液轉移于EP管中并加入異丙醇0.5 mL，混勻并于室溫條件下靜置10 min。使用Prime Script RT reagent Kit反轉錄試劑盒(賽默飛世爾中國公司)將總RNA進行反轉錄，從肺腺癌組織或癌旁組織中提取總RNA，分別得到模板單鏈cDNA，以18S rRNA作為內參，使用PCR試劑盒(北京康為世紀公司)對cDNA進行PCR。18S rRNA上、下游引物分別為5′-ACACGGACAGGATTGACAGA-3′、5′-GGACATCTAAGG GCATCACA-3′。lncRNA-ATB的上、下游引物分別為5′-TGACAAAGGCAG-GAGGTA-3′、5′-ATCTCTGGGTGCTGGTGAAGG-3′。miR-34a qRT-PCR擴增以U6作為對照基因，miR-34a上下游引物分別為5′-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTG-3′、5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；U6基因上下游引物分別為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。miR-145 qRT-PCR擴增也以U6作為對照基因，上、下游引物分別為 5′-TCGGTCCAGTTTTCCCAG-3′、5′-AGTGCGTGTCGTGGAGTC-3′；U6基因上、下游引物分別為5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′、5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′，lncRNA-ATB、miR-34a和miR-145、U6引物均由金斯瑞生物有限公司合成。最后采用2-ΔΔct計算組織中lncRNA-ATB、miR-34a和miR-145相對表達量(RQ)，并分別根據lncRNA-ATB、miR-34a和miR-145的RQ中位值將患者分為高、低表達組各56例。

1.3隨訪 所有患者隨訪時間為10～50個月，中位隨訪時間22.3個月，隨訪截止時間為2020年1月31日。每3個月隨訪1次，檢查內容包括患者腫瘤標志物、胸部 B 超以及CT，同時每年進行頭顱磁共振成像(MRI)以及骨掃描檢查。

2 結 果

2.1癌組織及癌旁組織中lncRNA-ATB、miR-34a和miR-145表達水平比較 癌組織中lncRNA-ATB表達水平顯著高于癌旁組織，miR-34a和miR-145表達水平顯著低于癌旁組織，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 癌組織及癌旁組織中lncRNA-ATB、miR-34a和miR-145表達水平比較

2.2lncRNA-ATB、miR-34a和miR-145不同表達水平患者術后生存情況比較 所有患者均順利完成手術，圍術期無死亡病例，截止至隨訪結束，共有24例患者死亡，所有患者的3年OS為78.57%。其中lncRNA-ATB高表達組死亡16例，3年OS為71.43%，低表達組死亡8例，3年OS為85.71%；miR-34a高表達組死亡5例，3年OS為91.07%，低表達組死亡19例，3年OS為66.07%；miR-145高表達組死亡6例，3年OS為89.29%，低表達組死亡18例，3年OS為67.86%。Log-rank檢驗顯示，各指標高、低表達患者的OS比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1～3。

圖1 lncRNA-ATB高、低表達組患者生存曲線圖

2.3影響患者預后的單因素和多因素Cox分析 對影響患者預后的因素進行單因素分析，并將差異存在統計學意義的因素作為自變量進行Cox多因素分析，以患者生存情況(賦值：死亡=1，生存=0)為因變量，Cox多因素分析結果顯示，腫瘤TNM分期升高、發生淋巴結轉移和胸膜侵犯、lncRNA-ATB高表達以及miR-34a、miR-145低表達是影響患者預后的獨立危險因素(P<0.05)。見表2。

圖2 miR-34a高、低表達組患者生存曲線圖

圖3 miR-145高、低表達組患者生存曲線圖

表2 預后影響因素的單因素和多因素Cox回歸分析

續表2 預后影響因素的單因素和多因素Cox回歸分析

3 討 論

肺癌的發病率和病死率在眾多惡性腫瘤中居首位，且在肺癌的發生發展過程中常伴隨多種調控因子的作用，故研究多種調控因子在肺癌患者中的表達水平差異，探討其對疾病發展機制和預后的影響具有重要的臨床意義。lncRNA作為一種長度為200個核苷酸以上的非編碼RNA分子，其一級結構類似于核苷酸排列順序，以往研究誤認為lncRNA屬于基因的“轉錄噪音”[6]。隨著研究深入，發現lncRNA占哺乳動物基因組序列中轉錄本的10%左右，相較于產生的1%編碼蛋白轉錄本更多，甚至具有較強的細胞或者組織特異性[7]。研究證實，lncRNA不僅直接調控靶基因轉錄以及翻譯過程，還可間接調控靶基因的上下游基因，其在基因重組、細胞周期調控、蛋白質轉錄和翻譯等多種生理過程中發揮重要的作用，與機體細胞生長、分化、凋亡等重要過程以及一些惡性腫瘤關系密切，為肺癌等惡性腫瘤的發生機制研究提供了重要方向[8]。lncRNA-ATB作為一種新發現的lncRNA，許多研究均證實其在惡性腫瘤的發生發展過程中發揮重要的調控作用，且與患者預后顯著相關[9-12]。丁如良等[9]研究結果顯示，結直腸癌患者的癌組織和血清中lncRNA-ATB過度表達，且患者的病灶大小、是否發生淋巴結轉移以及胸膜侵犯都會影響lncRNA-ATB的表達水平。預后研究顯示lncRNA-ATB呈過度表達的患者預后更差，中位生存期更短[10]。本研究結果顯示，肺腺癌患者癌組織lncRNA-ATB表達水平高于癌旁組織，與上述研究結論一致，提示lncRNA-ATB在肺腺癌等惡性腫瘤的發生發展過程中扮演癌基因角色。多因素分析顯示，除腫瘤TNM分期、是否發生淋巴結轉移和胸膜侵犯外，lncRNA-ATB表達水平也與患者預后有關。推測lncRNA-ATB表達水平可能與肺腺癌惡性程度以及轉移情況存在密切聯系，提示lncRNA-ATB可能在肺腺癌的病情進展中發揮重要作用。WANG等[11]研究結果證實，lncRNA-ATB參與了惡性腫瘤侵襲轉移級聯反應，并對該過程具有一定促進作用。SONG等[12]研究發現，lncRNA-ATB能夠通過上調E盒結合鋅指蛋白1(ZEB1)和鋅指蛋白(ZNF)-217的表達水平以誘導上皮-間質轉化，從而進一步促進乳腺癌的侵襲和轉移，故推測lncRNA-ATB可能是通過上述途徑促進肺腺癌的擴散和轉移，從而影響患者術后生存情況，與本研究結果相符。

隨著人們對miRNA在腫瘤發生發展過程中的作用機制的深入了解，miRNA在惡性腫瘤治療中的重要作用逐漸被揭示，不僅可以將其作為惡性腫瘤早期診斷和預后預測的一種生物標志物，miRNA還有望成為治療腫瘤的一種新型藥物。miRNA是一種由20～25個核苷酸組成的人體內源性非編碼小分子RNA，可參與調節胚胎發育、細胞分化凋亡等多種生物學過程。其可以與靶基因信使RNA(mRNA)之間發生相互作用，抑制轉錄后翻譯過程，從而對靶基因產生負性調控并降低相關蛋白表達量。miRNA對于惡性腫瘤的發生發展具有重要作用，扮演著癌基因或抑癌基因的角色[13]。miR-34a和miR-145能影響細胞周期以及染色體結構形成，已有研究證實，miR-34a和miR-145可以抑制多種惡性腫瘤細胞的增殖[14]。彭淑賢等[15]研究結果發現，肺腺癌患者癌組織中miR-34a表達水平顯著低于癌旁組織和正常組織，且在癌組織、癌旁組織、正常組織中呈依次升高趨勢；王瑞娟[16]研究結果顯示，肺腺癌組織中miR-145異常低表達，且隨著腫瘤病理分級越高、腫瘤細胞轉移程度越高，患者的miR-145表達水平越低。說明miR-34a和miR-145表達水平可以作為肺腺癌患者病情嚴重程度的監測指標。本研究結果顯示，肺腺癌組織miR-34a和miR-145表達水平低于癌旁組織，且miR-34a、miR-145低表達與患者預后相關，提示miR-34a、miR-145可能均屬于抑癌基因。段亞男等[17]研究證實miR-145可以靶向調控結締組織生長因子(CTGF)表達水平以發揮肺腺癌病情調控作用，CTGF是由多種細胞分泌合成的具有參與和調控細胞有絲分裂、增殖以及黏附過程的細胞因子，同時CTGF能夠影響新生血管生成以及腫瘤發生發展過程，其在肝癌等多種惡性腫瘤中呈顯著低表達。因此，可以將血清miR-145作為惡性腫瘤侵襲潛能以及預后預測的重要生物學指標。許晶晶等[18]報道miR-34a的目的調控mRNA是c-myc蛋白，c-myc是一種可以有效促進細胞進入DNA合成期以快速完成DNA合成與復制的特殊蛋白，因此可以將c-myc的高度表達作為腫瘤發生或發展的重要信息。而人體正常組織和細胞中的miR-34a能與c-myc特異性結合導致c-myc蛋白表達降低，產生明顯抑癌作用。

綜上所述，lncRNA-ATB在高齡肺腺癌患者癌組織中呈高表達，miR-34a、 miR-145在高齡肺腺癌患者癌組織中呈低表達，且lncRNA-ATB高表達，miR-34a、miR-145低表達是影響患者預后的獨立危險因素。