缺氧誘導的間充質干細胞外泌體對胃癌細胞生長和轉移的影響及機制*

杜 雄，李延新，段小瑞，康 婷

延安大學附屬醫院：1.病理科;2.腫瘤科，陜西延安 716000

胃癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，在中國其發病率位居惡性腫瘤第三位，病死率位居第二位，雖然隨著醫療技術的發展，胃癌的手術和化療均取得了一定的進展，胃癌患者的5年生存率逐漸提高，但仍低于30%[1-3]。由于缺乏早期診斷的特異性標志物，胃癌患者往往在確診時就已經處于中晚期，錯過了手術和化療的最佳時機，并且胃癌發生發展的分子機制尚不明確，治療靶點受限[4-5]，所以探究胃癌的發生機制對于其臨床診斷和治療至關重要。

腫瘤細胞和微環境細胞受到多種應激因素的影響，例如缺氧、代謝應激、氧化應激等[6]。缺氧是實體腫瘤的特征，癌細胞的快速生長導致局部缺氧，進而刺激腫瘤微環境中的各種基質細胞對腫瘤產生影響[7-8]。間充質干細胞是腫瘤微環境的重要組成部分，可有助于腫瘤的發生發展[9]。腫瘤外泌體是腫瘤細胞所分泌的納米級囊泡，可調控腫瘤的生長、轉移、免疫逃逸等[10]。但在缺氧條件下，間充質干細胞外泌體對胃癌細胞的影響研究較少，本研究探討了缺氧條件下間充質干細胞外泌體對胃癌細胞生長和轉移的影響。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 人骨髓間充質干細胞hBMSCs(美國ScienCell公司，Cat.XY-XB-1578)，人胃癌細胞MGC-803(美國ScienCell公司，Cat.ml-cs-0276)，兔源CD9抗體、兔源CD63抗體、兔源TSG101抗體、兔源p-β-catenin抗體、兔源β-catenin抗體(英國Abcam公司，Cat.分別為ab92726、ab134045、ab125011、ab246504、ab32572)，細胞凋亡檢測試劑盒(沈陽萬類生物技術有限公司，Cat.WLA030b)，CCK8檢測試劑盒(沈陽萬類生物技術有限公司，Cat.WLA074)，兔源CD44抗體、兔源c-myc抗體、兔源cyclin D1抗體、兔源GAPDH抗體、HRP標記山羊抗兔IgG(沈陽萬類生物技術有限公司，Cat.分別為WL03531、WL01781、WL01435a、WL01114、WLA023)，Matrigel膠(福麥斯生物技術有限公司，Cat.356234)，無外泌體胎牛血清(美國Gibco公司，Cat.A2720801)，流式細胞儀(美國Beckman公司)，透射電鏡(日本Hitachi公司)，0.4 μm的Transwell小室(美國康寧公司，Cat.3413)。

1.2方法

1.2.1細胞培養 (1)正常的hBMSCs培養：取液氮保存的細胞，于37 ℃水浴鍋中迅速解凍，然后轉移至細胞培養皿中培養，hBMSCs培養于含10%胎牛血清、1%非必須氨基酸、1%谷氨酰胺的DMEM/F12培養基中，MGC-803細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，細胞置于含5% CO2，37 ℃的細胞培養箱中培養，隔天更換細胞培養基，細胞生長至匯合率80%時進行細胞傳代。(2)缺氧誘導的hBMSCs培養：將hBMSCs細胞置于0.2% O2，5% CO2，37 ℃的細胞培養箱中，細胞培養2 d后收集細胞培養上清液，用于提取外泌體。

1.2.2外泌體的提取與鑒定 使用差速離心法提取正常間充質干細胞外泌體(Nom-exo)、缺氧誘導的間充質干細胞外泌體(Hypo-exo)，將正常培養和缺氧培養的hBMSCs培養基更換為無外泌體胎牛血清配制的完全培養基，繼續培養細胞，收集細胞培養上清液，使用差速離心法收集細胞上清液中的外泌體，主要步驟為：將上清液以3 000×g，4 ℃離心15 min去除死細胞；然后將上清液以6 000×g離心40 min，去除細胞碎片；10 000×g離心1 h，取上清液；100 000×g離心1 h，收集沉淀，用400 μL無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸外泌體。使用透射電鏡觀察外泌體的形態結構，拍照記錄。使用蛋白質印跡法(Western blot)檢測外泌體標志蛋白CD9、CD63、TSG101的表達水平。將MGC-803細胞分為Nom-exo組、Hypo-exo組和PBS組，分別與10 μg/mL的Nom-exo、Hypo-exo以及等體積的PBS溶液共孵育24 h后進行后續研究。

1.2.3細胞增殖 采用CCK8法檢測細胞增殖能力，將MGC-803細胞接種于96孔板，每孔5×103個細胞，每孔加入適量外泌體，使外泌體終濃度為10 μg/mL，96孔板中體積為100 μL，每組3個復孔，并設置24 h、48 h、72 h時間點對應的培養板，在細胞培養箱中培養，于對應時間點取出96孔板，每孔加入10 μL的CCK8溶液，于培養箱中孵育4 h后，使用酶標儀檢測各孔450 nm處的吸光度(A)值，A值越大，細胞增殖能力越強。

1.2.4細胞凋亡 將MGC-803細胞接種于6孔板中，加入外泌體，使其終水平為10 μg/mL，于細胞培養箱中培養24 h，按照細胞凋亡檢測試劑盒說明書，每孔5×104個細胞，用500 μL的染色緩沖液重懸細胞成單細胞懸液，隨后添加5 μL的異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和5 μL的碘化丙啶染料(PI)，混勻后室溫避光孵育15 min，并設置Annexin V-FITC和PI單陽性管用于熒光補償調節，空白管用于電壓調節；使用流式細胞儀檢測上述各樣品的熒光值，使用FlowJo v5.573軟件分析細胞凋亡數。

1.2.5細胞遷移與侵襲 Transwell小室用于檢測細胞遷移，Matrigel膠于4 ℃融化后，取50 μL平鋪于Transwell小室中用于檢測細胞侵襲。取MGC-803細胞用DMEM培養基稀釋至2.5×104個/毫升，取200 μL細胞接種于Transwell小室中，每孔5×103個細胞，每組3個復孔，每個小室中加入外泌體，使其終水平為10 μg/mL，小室放置于24孔板中，每孔加入600 μL含10%胎牛血清的完全培養基，并將上述24孔板轉移至細胞培養箱中培養24 h，小室底部用PBS清洗后用無水乙醇固定30 min，然后將小室倒扣，底部滴加結晶紫染色10 min，清洗后晾干，于顯微鏡下觀察、拍照并計數，比較各組細胞遷移數及侵襲數。

1.2.6Western blot 取各組與10 μg/mL外泌體共孵育后的MGC-803細胞1×106個，加入200 μL RIPA蛋白裂解液和2 μL PMSF蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min后，以12 000×g，4 ℃離心10 min，取上清液，即為細胞總蛋白。根據BCA蛋白定量試劑盒定量，定量后各組蛋白加入上樣緩沖液煮沸30 min，使蛋白樣品充分變性，然后進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，用5%的脫脂牛奶對聚偏二氟乙烯膜(PVDF)封閉2 h，然后以1∶1 000比例稀釋后的一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后二抗室溫孵育1.5 h，再用TBST洗膜后按照ECL試劑盒說明書配制發光液，并將PVDF膜浸入發光液中反應半分鐘，曝光并拍照，用Image J軟件對曝光結果進行定量分析。

2 結 果

2.1外泌體提取及鑒定 透射電鏡觀察外泌體形態結果顯示，外泌體具有雙層膜結構，形態呈“杯托樣”，粒徑在30～100 nm，Western blot檢測外泌體標志蛋白結果顯示，差速離心法提取的外泌體表達標志蛋白CD9、CD63、TSG101，符合外泌體的結構及生物學特征。見圖1～2。

圖1 透射電鏡觀察外泌體形態結構

2.2缺氧條件下間充質干細胞外泌體對胃癌細胞增殖能力的影響 相比于PBS組，Nom-exo組MCG-803細胞增殖能力顯著增加(P<0.05)，Hypo-exo組MGC-803細胞增殖能力亦顯著增加(P<0.05)，相比于Nom-exo組MCG-803細胞，Hypo-exo組MGC-803細胞增殖能力顯著增加(P<0.05)。見圖3。

圖2 Western blot檢測外泌體標志蛋白表達

圖3 間充質干細胞外泌體對胃癌細胞增殖能力的影響

2.3缺氧條件下間充質干細胞外泌體對胃癌細胞凋亡水平的影響 相比于PBS組，Nom-exo組MGC-803細胞凋亡水平顯著降低(P<0.05)，Hypo-exo組MGC-803細胞凋亡水平顯著降低(P<0.05)；而相比于Nom-exo組，Hypo-exo組MGC-803細胞凋亡水平亦顯著降低(P<0.05)。見圖4。

注：A、B、C分別為PBS組、Nom-exo組、Hypo-exo組細胞凋亡圖；D為細胞凋亡率的統計值圖。

2.4缺氧條件下間充質干細胞外泌體對胃癌細胞遷移能力的影響 相比于PBS組，Nom-exo組MGC-803細胞遷移數目顯著增加(P<0.05)，Hypo-exo組MGC-803細胞遷移數目顯著增加(P<0.05)；相比于Nom-exo組，Hypo-exo組MGC-803細胞遷移數目亦顯著增加(P<0.05)。見圖5。

注：A、B、C分別為PBS組、Nom-exo組、Hypo-exo組細胞遷移圖；D為平均細胞數的統計值圖。

2.5缺氧條件下間充質干細胞外泌體對胃癌細胞侵襲能力的影響 Nom-exo組MGC-803細胞侵襲數目顯著高于PBS組(P<0.05)，Hypo-exo組MGC-803細胞侵襲數目顯著高于PBS組(P<0.05)；并且Hypo-exo組細胞侵襲數目顯著高于Nom-exo組細胞侵襲數目(P<0.05)。見圖6。

注：A、B、C分別為PBS組、Nom-exo組、Hypo-exo組細胞侵襲圖；D為平均細胞數的統計值圖。

2.6缺氧條件下間充質干細胞外泌體對胃癌細胞Wnt/β-連環素(β-catenin)信號通路的影響 相比于PBS組，Nom-exo和Hypo-exo組MGC-803細胞中β-catenin磷酸化水平顯著升高(P<0.05)，CD44、c-myc、G1/S-特異性周期蛋白-D1(Cyclin D1)表達顯著上調(P<0.05)，并且Hypo-exo組MGC-803細胞β-catenin磷酸化水平，CD44、c-myc、Cyclin D1表達水平均顯著高于Nom-exo組(P<0.05)。見圖7。

注：A為各組蛋白表達情況；B、C、D、E分別為CD44、c-myc、Cyclin D1、p-β-catenin/β-catenin表達水平的統計值圖。

3 討 論

在腫瘤的生長過程中，腫瘤細胞生長迅速并且超過腫瘤血管新生的速度，腫瘤細胞群周圍毛細血管的氧有效彌散范圍不能滿足腫瘤快速生長的需要，導致腫瘤組織內毛細血管的氧和營養供應不均，由此形成腫瘤缺氧微環境。缺氧亦是腫瘤微環境的重要特征，研究表明，實體腫瘤中缺氧區域占0.35%～4.25%，中位氧含量約為2%[11]。缺氧的腫瘤微環境會調控腫瘤的血管新生、腫瘤代謝、免疫應答、生長、轉移以及腫瘤耐藥等過程[12]。間充質干細胞是腫瘤微環境中的重要基質細胞，在腫瘤的發生和發展過程中改造腫瘤微環境，調控腫瘤血管新生及免疫逃逸[13]。外泌體是腫瘤微環境中的重要組成部分，腫瘤微環境中的多種基質細胞均可通過分泌外泌體作為旁分泌介質而調控腫瘤的生長和轉移。本研究探討了缺氧誘導的間充質干細胞外泌體對胃癌細胞生長、轉移的影響及其機制。

本研究通過差速離心法提取了Nom-exo和Hypo-exo，鑒定結果顯示，所提取的Nom-exo和Hypo-exo形態結構和理化性質均符合外泌體的特征。有研究表明，缺氧條件下，間充質干細胞衍生的外泌體微小RNA(miR)-193a-3p、miR-210-3p、和miR-5100通過激活STAT3信號通路誘導上皮-間質轉化(EMT)，進而促進肺癌細胞的侵襲[14]。缺氧條件也可通過多種途徑誘導胃癌細胞的增殖和轉移，研究表明，低氧誘導的miR-224會促進胃癌細胞生長、遷移和侵襲，缺氧可通過誘導巨噬細胞活化而誘導胃癌的發生發展[15-16]。為了探究缺氧條件下間充質干細胞外泌體是否對胃癌細胞的生長和轉移有影響，本研究將Nom-exo和Hypo-exo與胃癌細胞共孵育后發現，相比于Nom-exo組，Hypo-exo組胃癌細胞MGC-803的增殖能力顯著增加，細胞遷移和細胞侵襲能力也顯著增加，Hypo-exo組MGC-803細胞的水平顯著低于Nom-exo組，提示缺氧條件下間充質干細胞外泌體也可以促進胃癌細胞的生長和轉移。

Wnt/β-catenin信號通路是調控腫瘤細胞生長和轉移的經典通路，該通路激活后β-catenin能夠與其他蛋白分子結合形成復合物，在病理條件下可調控相關蛋白的表達以促進腫瘤的發生發展[17]。c-myc、CD44、cyclin D1是Wnt信號通路下游的靶基因，隨著Wnt/β-catenin信號通路的激活而激活，調控原癌基因和抑癌基因的表達，進而促進腫瘤的生長和轉移[18-19]。已有許多研究表明Wnt/β-catenin信號通路參與調控腫瘤細胞的生長和轉移，例如，Wnt/β-catenin信號通路通過H3賴氨酸27乙酰化的表觀遺傳調控促進胃癌進展，Wnt/β-catenin途徑與多種微小RNA(miRNA)之間的相互作用可調節胃癌EMT，Wnt/β-catenin信號通路是調控胃癌進展的關鍵信號通路。本研究發現，相比于Nom-exo組，Hypo-exo組MGC-803細胞c-myc、CD44、cyclin D1表達水平均顯著升高，β-catenin磷酸化水平亦顯著升高，即Wnt/β-catenin信號通路被激活，說明缺氧條件下間充質干細胞外泌體能夠激活Wnt/β-catenin信號通路。

綜上所述，Hypo-exo能夠促進胃癌細胞的生長和轉移，其機制為激活胃癌細胞中的Wnt/β-catenin信號通路，但是外泌體中包含多種物質，研究最廣泛的是miRNA、長鏈非編碼RNA等，所以間充質干細胞中何種物質發揮調控作用還需進一步研究。