接觸環(huán)氧乙烷醫(yī)務人員尿液中N-乙酰基-S-(2-羥乙基)-L-半胱氨酸水平測定方法研究*

熊曉蕓，姜秋霞，楊飛朋

1.江蘇省疾病預防控制中心職業(yè)病防治所檢驗科，江蘇南京 210028；2.江蘇省中醫(yī)院大外科，江蘇南京 210004

環(huán)氧乙烷(EO)，又名氧化乙烯，是一種最簡單的環(huán)醚，在常溫下為無色帶有刺激性氣味的氣體，蒸汽壓高，30 ℃時可達141 kPa。高蒸汽壓特性使得EO作為消毒劑熏蒸消毒時穿透力較強，且不損害滅菌物品，被醫(yī)療機構廣泛應用于醫(yī)療用品諸如繃帶、縫線及手術器具等的消毒中。但EO具有致突變性、胎兒毒性和致畸特性，對睪丸功能具有不良影響，并能對體內(nèi)多個器官系統(tǒng)產(chǎn)生損傷。人體長期少量接觸EO可引起神經(jīng)衰弱綜合征和植物神經(jīng)功能紊亂。世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構已將EO列為1類致癌物。消毒后的醫(yī)療用品會有一定水平的EO殘留，《醫(yī)療器械生物學評價第7部分：環(huán)氧乙烷滅菌殘留量》[1]中規(guī)定，短期、長期和持久接觸器械EO殘留量的平均日劑量不應超過4 mg/d、2 mg/d和0.1 mg/d。我國醫(yī)護群體近880萬人，該群體在日常工作中長期、頻繁接觸EO消毒后的醫(yī)療用品，導致的職業(yè)暴露、職業(yè)損傷時有報道[2-7]。國內(nèi)外都制定了EO職業(yè)接觸限值，《工作場所空氣有毒物質(zhì)測定方法：環(huán)氧化合物》[8]中規(guī)定了工作場所空氣中EO的采集和測定方法，通過個體采樣的方式可有效評估醫(yī)務人員經(jīng)呼吸道吸入的EO暴露量，未考慮皮膚、黏膜等接觸產(chǎn)生的暴露，本研究通過測定EO在尿液中的生物標志物N-乙酰基-S-(2-羥乙基)-L-半胱氨酸(HEMA)水平以評估該群體實際內(nèi)暴露水平。已有多項研究報道了尿液中HEMA測定的方法[9-11]。本研究參考已報道的方法，根據(jù)國內(nèi)同類實驗室現(xiàn)況，優(yōu)化了尿液中HEMA的測定方法，初步應用于評估接觸EO醫(yī)務人員的職業(yè)暴露情況。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年8月江蘇省中醫(yī)院日常工作中接觸、使用EO消毒醫(yī)療用品的12名手術室器械護士作為試驗組，均為女性，年齡21～33歲；另選取同期未接觸EO消毒醫(yī)療用品的12名放射科醫(yī)護志愿者作為對照組，均為女性，年齡23～35歲，兩組年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2儀器與試劑 超高效液相色譜儀(UPLC)(30A，日本島津公司)，配備三重四極桿質(zhì)譜(QTRAP 5500，美國AB公司)；Acquity UPLC BEH C18液相色譜柱(100 mm ×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司)；Millipore純水機；SIGMA臺式離心機。HEMA標準品(純度大于98%，美國TRC公司)；甲醇(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(A.R，南京化學試劑有限公司)；乙腈(色譜純，德國Merck公司)、乙酸(色譜純，上海Aladdin公司)；流動相用水為去離子水。

1.3方法

1.3.1溶液配制 (1)標準儲備液(1 000 μg/mL)：稱取10 mg HEMA標準品于10 mL容量瓶中，用10%甲醇溶液溶解，定容后-20 ℃冷凍避光保存。(2)標準中間液(100 μg/mL)：取1 mL標準儲備液于10 mL容量瓶中，用10%甲醇溶液稀釋，定容后4 ℃冷藏避光保存。(3)0.2%乙酸水溶液：2 mL乙酸用去離子水定容至1 L，用作流動相水相。

1.3.2標本制備 收集兩組研究對象工作日24 h尿液(甲苯防腐)，分別混勻后取出部分尿樣分裝到5支10 mL標本管中，與剩余尿樣一并冷凍保存；測定前取其中1支分裝至標本管，室溫下解凍，混合均勻后取1.0 mL的尿液，加20 μL的甲酸酸化，12 000 r/min離心10 min，上清液過0.22 μm微孔濾膜；移取200 μL濾液至棕色進樣瓶中，加800 μL 0.2%甲酸水溶液，混勻后待測。

1.3.3儀器條件 (1)色譜條件：流動相為0.2%乙酸水溶液和乙腈，采用梯度洗脫程序，乙腈的體積分數(shù)在0.0～<1.0 min內(nèi)為5%，1.0～<4.0 min內(nèi)線性增加至95%，4.0～<5.0 min內(nèi)維持在95%，5.0～5.5 min內(nèi)線性減少至5%，平衡至6.0 min結束；流量為0.5 mL/min；柱溫箱設定為40 ℃；進樣2.0 μL，保留時間為1.74 min。(2)質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源，負離子掃描，多反應監(jiān)測(MRM)模式；將10 μg/mL HEMA標準溶液注入三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀的一級質(zhì)譜中并進行掃描，選擇確定化合物分子離子峰豐度最大的質(zhì)譜條件；再在二級質(zhì)譜中進行子離子掃描，調(diào)整優(yōu)化碰撞能量，在保證子離子分辨率的前提下獲得最佳靈敏度；HEMA分子結構中存在羧基，電離方式采取電噴霧離子源質(zhì)譜；根據(jù)色譜條件優(yōu)化后的保留時間(1.74 min)截取1.0～2.5 min流動相進質(zhì)譜儀；噴霧電壓-4.5 kV；離子源溫度540 ℃；霧化氣流量8.4 L/min，氣簾氣流量30.5 L/min，輔助霧化氣流量6.8 L/min，錐孔電壓為-40 V；母離子m/z為206，子離子m/z分別為75和77(定量離子)，碰撞能量分別為-34 eV和-18 eV。

1.3.4定量方式 分別使用去離子水和空白尿液(經(jīng)上述標本制備程序處理，HEMA水平小于方法檢測限)繪制標準曲線和工作曲線，HEMA在0.1～100.0 μg/mL內(nèi)，工作曲線的斜率為標準曲線斜率的70%，存在較強的基質(zhì)效應，確定采用工作曲線法來定量。

1.3.5方法學參數(shù)測定 按照《職業(yè)衛(wèi)生標準制定指南第5部分:生物材料中化學物質(zhì)測定方法》[12]中“測定方法性能指標的試驗”相關要求進行方法學參數(shù)的確定。線性范圍、檢出限:用上述空白尿液繪制工作曲線,以定量離子峰面積與HEMA水平作工作曲線。回收率與精密度:用空白尿液加標,添加水平至5.0、20.0、80.0 μg/mL(方法測定范圍內(nèi)低、中、高水平),各做6個平行,經(jīng)前處理后上機測定。

2 結 果

2.1質(zhì)量色譜圖 在上述色譜、質(zhì)譜條件下，HEMA峰型良好，保留時間為1.74 min，見圖1。

圖1 HEMA加標樣品質(zhì)量色譜圖

2.2方法學參數(shù)測定結果 HEMA的線性范圍為在0.1 ～100.0 μg/mL ,相關系數(shù)為0.999 1;3倍信噪比計算的方法檢出限為0.03 μg/mL,10倍信噪比計算的方法定量限為0.1 μg/mL。當加標水平為5.0、20.0、80.0 μg/mL時，加標回收率為91.6%～94.7%,批內(nèi)精密度為4.7%～7.2%,連續(xù)測定3 d的批間精密度為4.5%～8.1%。

2.3試驗組與對照組尿液中HEMA水平比較 對照組尿液中HEMA的水平為(1.44±0.29) μg/g肌酐，試驗組尿液中HEMA水平為(2.30±1.45) μg/g肌酐，兩組HEMA水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 對照組、試驗組尿液中HEMA水平比較

3 討 論

《工作場所有害因素職業(yè)接觸限值第1部分：化學有害因素》[13]中EO的時間加權平均容許水平(PC-TWA)為2 mg/m3，且提示EO除通過吸入接觸外，還可通過皮膚、黏膜和眼睛直接接觸，經(jīng)完整的皮膚吸收而引起全身效應，即使空氣中EO的水平≤PC-TWA，勞動者仍有可能通過皮膚接觸而引起過量接觸。醫(yī)護人員在日常工作中，皮膚、黏膜會長期、頻繁接觸消毒后醫(yī)療用品殘留的EO及其蒸氣，現(xiàn)有的測定方法僅關注吸入接觸，無法完整評估醫(yī)護群體的實際暴露水平。現(xiàn)有研究普遍認為，HEMA是EO在尿液中的主要代謝產(chǎn)物，丙烯腈、1,2-二溴乙烷和氯乙烯也可以通過代謝產(chǎn)生HEMA，但醫(yī)護人員一般不會接觸[9-11]。本研究將HEMA作為醫(yī)護人員EO職業(yè)暴露的生物標志物，通過測定其在尿液中的水平來評估該群體真實內(nèi)暴露水平。

健康人24 h尿量為0.8～2.0 L，收集研究對象工作日24 h尿液(甲苯防腐)，測定其中的HEMA水平，可準確評估其EO內(nèi)暴露水平；混勻后采取小體積分裝方式冷凍保存便于單指標重復測定及多指標測定的開展，避免大體積標本的反復凍融造成待測物損失及標本基質(zhì)情況的改變。目前主流UPLC配備的色譜柱填料粒徑普遍不超過2 μm(本研究所用色譜柱填料粒徑為1.7 μm)，分離能力得到極大提升，搭配三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜，可有效控制質(zhì)譜檢測的離子抑制現(xiàn)象并降低待測物的檢出限，為在樣品前處理方式中采取酸化、離心、過濾、稀釋后直接上機測定的方法提供了技術支撐，為國內(nèi)未購置自動固相萃取儀的實驗室開展相關檢測提供簡便、有效的解決方案。以去離子水搭配有機溶劑作為流動相時，HEMA峰型較差；在水相中加入乙酸并逐步提高比例至0.2%時，峰型得到最佳優(yōu)化；在甲醇、乙腈兩種常用有機溶劑作為有機相過程中，使用乙腈與使用甲醇響應值無明顯區(qū)別，但乙腈因具有較強的洗脫能力，在縮短分析時間的同時能實現(xiàn)基線較好分離。本研究結果顯示，試驗組與對照組的尿液中HEMA水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示兩種可能：(1)對照組檢出水平反映了人群尿液中HEMA基礎水平，試驗組EO內(nèi)暴露水平極低，后續(xù)可通過擴大試驗組崗位類別及調(diào)查范圍進一步評估該群體EO內(nèi)暴露水平；(2)對照組檢出水平未能反映人群尿液中HEMA基礎水平，對照組對象存在其他行為造成非EO接觸導致的HEMA水平升高，除接觸丙烯腈、1,2-二溴乙烷和氯乙烯等化學物質(zhì)外，有文獻報道吸煙也可導致尿液中HEMA水平升高[14]，后續(xù)可通過問卷調(diào)查的方式全面了解擬納入人群是否有可能影響HEMA水平升高的生活方式和相關化學物質(zhì)的接觸可能，確保研究中對照組檢出水平能真實反映人群尿液中HEMA基礎水平，再通過擴大試驗組崗位類別及調(diào)查范圍等方式保證該群體EO真實內(nèi)暴露水平得到準確評估。

本研究通過建立簡便實用、便于推廣的方法測定接觸EO醫(yī)務人員尿液中HEMA水平，初步獲得12名接觸EO醫(yī)務人員尿液中的HEMA水平，為準確評估研究群體EO真實內(nèi)暴露水平提供了可靠的技術方案，暴露水平的準確評估能為衛(wèi)生健康管理部門的決策提供參考，也為我國醫(yī)療機構建設相關防護設施，配備相關防護用品，更好地保護接觸EO醫(yī)護群體健康提供準確數(shù)據(jù)支撐。

綜上所述，通過優(yōu)化前處理方式、色譜條件、質(zhì)譜參數(shù)及定量方式，本研究所使用方法的線性范圍、檢出限、回收率與精密度等主要性能指標均滿足《職業(yè)衛(wèi)生標準制定指南第5部分：生物材料中化學物質(zhì)測定方法》的要求，適用于接觸EO醫(yī)務人員尿液中HEMA水平的測定，所需儀器設備均較常見，便于推廣。