GSDME通過p53、caspase3增強小細胞肺癌細胞的紫杉醇敏感

高世華 李植鋒 蔡鍵鋒

肺癌根據組織形態學特征可分為小細胞肺癌(small-cell lung cancer, SCLC)和非小細胞癌(non-small-cell lung ancer, NSCLC)，其中SCLC占據肺癌的15%～20%，與NSCLC比較，SCLC的侵襲性更強、早期轉移率更高、預后效果更差[1]。SCLC對化療較為敏感，第一療程治療后癥狀通常能得到改善，但很快會產生多藥耐藥性，導致其預后依然欠佳，中位總生存期不足6個月[2]。因此，探究增強SCLC對化療藥物的敏感度具有重要意義。隨著科技的發展，多種細胞死亡形式被逐漸發現，包括細胞壞死(necrocytosis)、細胞凋亡(apoptosis)、細胞自噬(autophagy)以及細胞焦亡(pyroptosis)等。其中，細胞焦亡是一種介于凋亡與壞死之間的死亡方式，發生速度快，可誘發機體強烈的炎性反應。Gasdermin蛋白E(gasdermin E, GSDME)是細胞焦亡的最終執行蛋白，同時其剪切活化也是焦亡發生的標志[3]。由于GSDME可介導化療藥物引起的組織損傷，腫瘤中GSDME的表達量較高，此腫瘤可能對化療藥物更為敏感[4]。紫杉醇(paclitaxel，PTX)是一種有絲分裂抑制劑，是近年來最有效的廣譜化療藥物之一，治療晚期NSCLC有效率高達20%～42%[5]。本研究擬探討過表達GSDME在紫杉醇治療SCLC中的增敏作用及其可能的分子機制。

材料與方法

1.組織標本、細胞系和主要試劑：人小細胞肺癌細胞株(H69、H146、H209、H446、H1688、H2227)、人支氣管上皮細胞株(16HBE)、過表達GSDME的H69細胞株(H69-GSDMEhight)購自廣州賽業生物科技有限公司；RPMI-1640培養基、胎牛血清、青鏈霉素混合液(×100)購自美國 Gibco公司；p53通路抑制劑(PFT-α)、caspase3抑制劑(Ac-DEVD-CHO, DEVD)購自美國Selleck公司；GSDME、β-actin多克隆抗體購自上海圣克魯斯生物技術公司；通用RT-PCR試劑盒、LDH細胞毒性試劑盒、CCK-8試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

2.細胞培養：使用含10%小牛血清、1%青鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養基作為完全培養液，培養于37℃、5%CO2培養箱中。

3.實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測GSDME水平：利用Trizol法提取細胞總RNA，測定濃度和純度后，反轉成cDNA。以cDNA為模板，進行RT-qPCR，程序為預變性95℃，10min，變性95℃，10s，退火60℃，20s，延伸72℃，30s，40個循環。以GAPDH為內參進行分析，使用2-ΔΔCt法分析計算GSDME基因的相對表達量，每個樣品均重復3次。引物: GSDME-上游引物:5′-CGTAGAGAGCCAGTCTTCATTT-3′; GSDME-下游引物:5′-GTTCCAGGACCATGAGTAGTTC-3′; GAPDH-上游引物:5′-CAAGGACCTCTACGCCAACAC-3′; GAPDH-下游引物:5′-TGGAGGCGCGATGATCTT-3′。

4.Western blot(WB)法檢測GSDME蛋白表達：細胞分組處理后，收集細胞提取總蛋白，BCA法測定蛋白裂解液濃度，取等量蛋白進行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉至PVDF膜上。2%脫脂牛奶封閉；一抗4℃孵育過夜，洗膜后與二抗室溫孵育30min; 洗膜后加ECL顯影液，放入凝膠分析系統中曝光，拍照存儲并用Image J軟件分析計算各條帶的灰度值，以每組目的蛋白和內參蛋白灰度值的比值表示各組蛋白的表達水平。

5.乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase, LDH)檢測：細胞經藥物處理后，收集各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相應孔中，隨即進行樣品測定。用酶標儀測量A450值，根據標準曲線求出相應的LDH含量。具體步驟按試劑盒說明書操作。

6.CCK-8：收集對數生長期細胞，PBS洗滌后使用完全培養基重懸，濃度調至4×104個細胞/毫升，以100微升/孔接種于96孔板。培養箱孵育過夜后，分別加入不同濃度的紫杉醇(0、30、60、80、100μmol/L)處理細胞，每組均有6個平行孔，藥物作用時間分為0、4、8、12、16h。在各組實驗終止前4h，加入現配的CCK-8溶液(10微升/孔)，孵育培養4h后，酶標儀測定450nm處的吸光度，計算存活率，繪制曲線。

7.流式細胞術：使用不含EDTA胰酶消化并收集細胞，細胞篩過濾后進行計數，然后將細胞密度稀釋調整為1×106個/毫升，用0.3ml Buffer緩沖液重懸細胞于流式。然后加5μl Annexin V-FITC，室溫避光染色30min，再加10μl PI染液，室溫避光染色20min，通過流式細胞儀儀檢測細胞焦亡情況。

結 果

1.GSDME在SCLC細胞株中的表達：在SCLC細胞系H69、H146、H209、H446、H1688、H2227細胞中GSDME mRNA表達水平明顯低于對照組16HBE細胞(P<0.01，圖1A)，且在H69細胞中的表達量最低(0.37±0.03)。在各細胞系中，GSDME蛋白表達水平的表達也顯著低于對照組(P<0.01，圖1B)。

圖1 GSDME在SCLC細胞株中的表達A.SCLC細胞株中GSDME mRNA的表達量;B.SCLC細胞株中GSDM蛋白的表達量;與16HBE細胞比較，*P<0.01

2.過表達GSDME增強SCLC細胞對紫杉醇的敏感度：與H69細胞組比較，經30、60、80、100μmol/L濃度紫杉醇處理后，H69-GSDMEhight細胞的生存率均顯著降低(P<0.01，圖2A)；與H69細胞組比較，經紫杉醇作用4、8、12、16h后，H69-GSDMEhight細胞生存率均顯著降低(P<0.05，圖2B)。與0μmol/L紫杉醇處理組比較，GSDME-NT水平在30、60、80、100μmol/L紫杉醇處理組均顯著增加(P<0.01)；與30μmol/L紫杉醇處理組比較，GSDME-NT水平在60、80、100μmol/L紫杉醇處理組均顯著增加(P<0.05)；與60μmol/L紫杉醇處理組比較，GSDME-NT水平在80、100μmol/L紫杉醇處理組均顯著增加(P<0.01，圖2C)。

圖2 紫杉醇影響SCLC細胞生存率和GSDME的切割A.紫杉醇處理劑量與細胞生存率的關系，與H69組比較，*P<0.01；B.紫杉醇處理時間與細胞生存率的關系，與H69組比較，*P<0.05，**P<0.01；C.紫杉醇誘發GSDME切割成GSDME-NT的劑量依賴性;與0μmol/L組比較，*P<0.01；與30μmol/L組比較，#P<0.05，##P<0.01；與60μmol/L組比較，ΔP<0.01

3.紫杉醇誘導過表達GSDME的SCLC細胞發生細胞焦亡：紫杉醇處理(80μmol/L,8h) H69-GSDMEhight細胞后培養上清中LDH酶活為17.70±1.10U/L，未處理組的LDH酶活力為5.53±0.53U/L，差異有統計學意義(P<0.01，圖3A)。紫杉醇誘導H69-GSDMEhight細胞死亡以焦亡(Annexin-V FITC+/IP+細胞)為主(圖3B)。

圖3 紫杉醇誘導SCLC細胞的死亡方式A.LDH水平檢測，與未處理組比較，**P<0.01；B.流式細胞術檢測H69-GSDMEhight細胞的死亡方式

4.阻斷p53或caspase3影響紫杉醇通過GSDME介導SCLC細胞焦亡：使用caspase3抑制劑(DEVD, 10μmol/L)和p53抑制劑(PFT-α, 10μmol/L)分別對H69-GSDMEhight細胞進行預處理，再經過紫杉醇(80μmol/L)處理，觀察各組細胞焦亡情況。與PTX處理組比較，PTX+DEVD處理組和PTX+PFT-α處理組H69-GSDMEhight細胞中的GSDME-NT水平均顯著降低(P<0.01，圖4)。

討 論

SCLC是一種起源于支氣管黏膜上皮的神經內分泌腫瘤，其特點是惡性程度高、侵襲性高、進展快、早期出現遠處轉移，廣泛期小細胞肺癌預后極差[6]。目前，對SCLC的治療沒有絕對有效的方案，因此探究新的治療方法提高生存收益具有重要意義。近年來，細胞焦亡被證實是一種新的細胞程序性死亡方式，通過caspase家族蛋白切割并激活gasdermin家族蛋白，進而導致細胞膜穿孔和破裂，引起細胞內容物的釋放誘導細胞死亡，并且伴隨強烈的炎性反應[7]。已有多項研究報道GSDME介導了腫瘤患者化療時的細胞焦亡[8]。本研究通過檢測多株SCLC細胞中的GSDME的表達量，分析GSDME與SCLC的相關性。與對照相比較，SCLC腫瘤細胞系中DSDME的mRNA水平和蛋白水平均顯著下調，說明GSDME的表達與SCLC的發生、發展可能存在關系。

臨床上一線治療對大多數SCLC患者均有較好的療效，但是在治療后2年內復發的患者甚多，尤其是廣泛期患者2年復發率接近100%，患者復發后的平均生存時間也極低[9]。因此在患者體能狀態允許情況下，臨床多推薦建議復發者采納二線化療法，以期延長患者總生存期和無進展生存時間，減少腫瘤負荷。目前，二線化療方案多是選擇伊立替康、紫杉醇、多西他賽、吉西他濱中的一種藥物與鉑類聯合用藥[10]?；熕幬锟赏ㄟ^細胞凋亡和繼發性壞死等一系列調控細胞死亡途徑誘導癌細胞死亡，有研究指出化療藥物誘導細胞焦亡過程由GSDME介導[11]。GSDME蛋白表達水平在不同腫瘤細胞中存在差異，其本底表達水平與化療藥物敏感度有著密切聯系[12]。GSDME在大多數腫瘤組織中表達缺失或發生突變，有研究顯示上調GSDME在肝細胞癌中的表達可使其增殖被顯著抑制[13]。因此，本研究探討了紫杉醇在過表達GSDME的SCLC腫瘤細胞的作用效果，結果顯示過表達GSDME能夠增強SCLC細胞對紫杉醇的敏感度。

細胞焦亡和凋亡是細胞程序性死亡的兩種形式。與凋亡相反，細胞焦亡是腫瘤細胞繼發性壞死的主要形式，它是由caspase-3依賴性的GSDME裂解引起的。GSDME蛋白裂解產生的GSDME-NT可在細胞膜上成孔，電解質失去平衡，細胞內容物外泄，進而導致細胞繼發性壞死/焦亡，因此GSDME-NT也被認為細胞焦亡的標志性蛋白[14]。已知化療藥物可以通過激活caspase-3介導的細胞凋亡來殺死細胞，Wang等[11]研究發現，化療藥物在體外誘導GSDME細胞凋亡，使其被caspase-3裂解，該機制被認為是在細胞凋亡后引起繼發性壞死。GSDME是抑癌基因p53的轉錄調控靶點，協同p53參與了腫瘤細胞的DNA損傷應激等[15]。本研究通過caspase-3抑制劑和p53抑制劑分別處理過表達GSDME的SCLC細胞，會顯著降低紫杉醇導致的GSDME活化，即阻斷紫杉醇誘導SCLC細胞的焦亡。

綜上所述，GSDME在SCLC中低表達，體外通過過表達細胞中GSDME的表達，能夠有效增強SCLC細胞對紫杉醇的敏感度，且該過程受p53、caspase-3活化的影響。本研究結果表明GSDME在SCLC的治療中具有一定的研究價值，為深入了解SCLC的發病機制提供了理論依據。