自噬對骨質疏松的影響及中藥的調控作用研究進展

李玉曼 馬紫童 王 瀚 劉仁慧

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減少、骨的微觀結構退化為特征，骨脆性增加，易發生骨折的一種全身性骨骼疾病。其發病機制主要在于骨形成和骨吸收間的動態平衡的破壞。隨著我國進入老齡化社會，OP的發生率日益增高，嚴重影響患者身體和心理健康，為社會和家庭增加負擔，因此如何防治OP成為亟待解決的問題。

自噬是一種在所有真核生物細胞中普遍存在的、進化上保守的過程，具有許多生理功能。自噬可更新長壽命蛋白，去除多余或受損的細胞器；針對多種脅迫條件(如營養限制、熱以及氧化脅迫)產生細胞應答而被誘導。在細胞的發育和分化中發揮作用。越來越多證據表明自噬參與維持骨代謝平衡，在OP的發病機制及防治中起到重要作用。

一、自噬參與骨質疏松癥發病機制

自噬參與多種類型的OP的發病機制。Rinaldo等[1]總結了自噬途徑的失調與OP之間的可能關系：衰老、長期使用糖皮質激素(glucocorticoid，GC)和雌激素缺乏可增加骨組織氧化應激，誘導成骨細胞(osteoblast，OB)和骨細胞凋亡，并增加破骨細胞(osteoclast，OC)的骨吸收，從而導致骨丟失。另一方面，氧化應激增加刺激自噬途徑，通過降解受損的蛋白質和細胞器，減少細胞應激，抑制OB和骨細胞凋亡，減輕骨丟失和OP。衰老引起的自噬減少會導致氧化應激增加。雌激素缺乏和氧化應激引起的自噬增加活化OC，而導致骨丟失和隨后的OP。

1.自噬與絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)：OP常見于絕經后婦女，由于機體卵巢功能減退和雌激素水平下降，影響骨骼細胞活性并導致骨丟失，是常見的OP類型。PMOP與自噬關系密切，研究表明，卵巢切除大鼠的自噬水平減弱，但過表達的損傷調節自噬因子可能會增加OB的自噬水平，抑制增殖并誘導凋亡。雌激素具有增強OB線粒體自噬活性的功能，骨細胞區microRNA通過胰島素樣生長因子1/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路參與雌激素提高骨細胞自噬活動。激活自噬能夠增加骨量，減少骨髓腔內脂肪組織形成，增強骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchy-mal stem cells，BMMSCs)成骨分化而減弱其成脂分化[2]。但也有研究得到了相反的結論，認為卵巢切除大鼠體內自噬水平升高，雌激素可逆轉升高的自噬水平，通過調控GPER影響PI3K/Akt/ mTOR信號通路抑制OB和軟骨細胞線粒體自噬[3]。

2.自噬與老年性骨質疏松癥(senile osteoporosis，SOP)：SOP是增齡等綜合因素導致的一種以骨量低下，骨微結構損壞，骨脆性增加，容易發生骨折為特征的全身性骨病。研究發現，衰老小鼠自噬能力下降可誘發SOP，自噬誘導劑雷帕霉素通過促進OB功能活動，減少OC數量并抑制OC活動，抑制骨細胞凋亡，促進骨細胞自噬，對SOP起到了明顯的骨保護作用。氧化應激與SOP關系密切，隨年齡增長，氧化應激水平升高，抗氧化能力減弱，骨量減少，激活自噬能降低BMMSCs細胞的活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平，抑制自噬能提高BMMSCs細胞的ROS水平，調節自噬可影響細胞周期和細胞凋亡，并恢復大鼠骨丟失[2]。

3.自噬與糖皮質激素性骨質疏松癥(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)：研究表明，GC可誘導骨組織中BMMSCs、OB、OC、骨細胞自噬，發揮骨保護作用。而高濃度GC損害了BMMSCs的增殖，誘發自噬，使用自噬抑制劑3-MA后進一步抑制BMMSCs的增殖并促進其凋亡，表明自噬能夠維持其增殖活力并抑制高濃度GC造成的凋亡，在GC刺激的應激環境下保護細胞。在OB中GC以劑量依賴的方式調節自噬，隨著時間的推移，自噬水平在48h達到峰值，然后逐漸下降。GC誘導OB凋亡，抑制OB基因的表達，抑制自噬可進一步促進細胞凋亡和抑制基因表達，自噬通過與Bax/Bcl-2的相互作用是OB凋亡的重要調節因子。地塞米松可能通過抑制Akt/mTOR信號通路、調節ROS/SIRT1/FOXO3通路誘導OB或OC自噬來發揮其在GIOP中的保護作用[4]。

4.自噬與糖尿病性骨質疏松癥：研究表明，糖尿病抑制OB骨形成作用強于抑制OC骨吸收作用，減少大鼠骨形成，降低骨密度。高糖環境BMMSCs細胞微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)Ⅱ表達增加，自噬水平升高，并通過介導Wnt/β-catenin通路中的相關因子表達加強對衰老細胞的吞噬作用并提高其成骨分化的能力。高糖環境抑制OB可能與細胞內氧化應激水平升高、線粒體損傷和自噬有關，通過ROS-Akt-mTOR軸及ERK/p38MAPK通路影響OB自噬，進而影響其增殖和凋亡。高糖環境影響OC是通過AMPK/mTOR/ULK1信號通路抑制OC形成過程中的自噬，減弱OC的形成與功能[2]。

二、調節自噬防治OP的中藥及復方研究

OB和OC來源具有同一性，其間存在生克制化關系，陽性、陰性調控因子以及陰陽屬性的相對性。吳克亮等[5]研究認為，OB及其主導的骨生成屬于“陰”，OC及其主導的骨吸收屬于“陽”，二者動態平衡發揮維持骨穩態的作用，二者失衡造成的骨穩態破壞是OP的基本病理改變。從微觀層面來說，自噬利于細胞生存的作用為“陽”，誘導細胞死亡的作用為“陰”，細胞通過自噬降解屬性為“陰”的無用的細胞器、蛋白質等代謝產物，化生屬性為“陽”的新的分子元素為細胞提供能量，實現物質和能量的更新，陰陽此消彼長，達到平衡。若自噬過度，則過快過多地分解代謝產物，造成細胞損傷。若自噬不足，則代謝產物堆積，再循環利用能量不足，不利于細胞生成與存活。這與OP中骨穩態失衡的病理狀態相契合。目前中藥基于自噬防治OP的作用機制研究以單味藥為主。

1.單味藥研究

(1)補陽藥：腎藏精，主骨生髓，基于中醫理論，腎虛精虧是導致OP的主要病機，故臨床主要采用補腎法治療。淫羊藿、巴戟天、仙茅具有補腎陽、強筋骨之功效。淫羊藿主要成分淫羊藿苷能夠改善卵巢切除所致PMOP大鼠骨微結構，上調自噬相關蛋白的表達。增強BMMSCs成骨和礦化能力，上調成骨相關蛋白BMP2、RUNX2和自噬相關蛋白LC3的表達，下調p62蛋白的表達。改善自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤引起的骨小梁數目減少、骨小梁厚度和骨皮質變薄的加劇[6]。體外研究中，淫羊藿苷能增加小鼠前體成骨細胞株(MC3T3-E1)自噬體的數量，上調成骨分化標志物collagen Ⅰ、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、Runx2及自噬相關基因ULK1、FIP200、ATG13的mRNA和蛋白的表達；提取7～10天齡的SD雄性大鼠膝關節軟骨細胞，淫羊藿苷通過下調NF-κB信號通路減弱腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α誘導的軟骨細胞凋亡，激活自噬過程[7]。仙茅有效成分仙茅苷可在用游離鐵螯合劑去鐵胺處理的鐵超載OB細胞中抑制抗氧化酶上游蛋白FOXO1磷酸化，升高FOXO1，從而升高其下游蛋白抗氧化酶和自噬相關蛋白LC3B水平，促進OB自噬，抑制鐵超載引起的OB的氧化損傷，增強OB骨形成的作用[8]。巴戟天有效成分水晶蘭苷通過Akt/mTOR通路增強自噬介導抗氧化作用，保護氧化應激暴露中的OB[9]。

(2)補氣藥:人參可大補脾臟、腎臟、心臟、肺之氣，其有效成分人參皂苷Rb2能抑制去勢小鼠NF-κB信號通路和調控mTOR介導的自噬信號通路抑制OC形成和分化[10]。甘草具有補脾益氣之效，在體外培養的RAW 264.7細胞以及體內腹腔注射中，發現其有效成分異甘草素可阻斷NF-κB通路下調自噬，從而抑制體外OC分化和體內OC形成和炎性骨吸收[11]。紅景天具有益氣活血之效，其有效成分紅景天苷能在PMOP患者中通過調控缺氧誘導因子1α多肽(hypoxia-inducible factor 1-α，HIF-1α)介導的自噬從而抵抗骨細胞凋亡，拮抗氧化應激改善OP[12]。

(3)活血化瘀藥：川芎具有活血行氣、祛風止痛的功效，其有效成分川芎嗪能夠通過AMPK/mTOR途徑誘導自噬從而保護高GC刺激的成骨分化的抑制和BMMSCs的凋亡[2]。牛膝具有逐瘀通經、補肝腎、強筋骨的功效，其有效成分牛膝甾酮在體外可通過上調成骨分化相關基因collagenⅠ、OPG、OPN、OCN的表達及刺激自噬體的形成從而促進OB分化。β-蛻皮甾酮可下調GIOP大鼠中自噬相關蛋白Beclin1、ATG5、LC3Ⅰ/Ⅱ和凋亡[13, 14]。

(4)清熱藥：穿心蓮具有清熱解毒涼血、消腫、燥濕的功效，其有效成分穿心蓮內酯在體外能夠通過抑制TNF-α激活的自噬相關NF-κB通路保護和促進BMMSCs成骨分化；通過抑制NF-κB通路的活化還可抑制OC分化，從而抑制骨丟失；通過調控ERK通路促進OB增殖、激活Wnt/β-catenin 促進成骨分化，從而增加骨合成[15]。知母具有清熱瀉火、滋陰潤燥的功效，其有效成分芒果苷可在由叔丁基過氧化氫構建的軟骨細胞損傷模型中通過激活AMPK信號通路增加軟骨細胞自噬并減少凋亡[16]。苦參具有清熱燥濕、殺蟲利尿的功效，其有效成分苦參堿可通過調控NF-κB/AKT/MAPK通路，抑制破骨細胞生成，抑制炎性反應，減輕卵巢切除小鼠OP癥狀[17]。

2.中藥化學成分研究

白藜蘆醇是一類天然多酚化合物，來源于虎杖、葡萄等多種植物，表現出多種活性。白藜蘆醇能增強GIOP大鼠模型SIRT1活性，抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，促進OB自噬，影響RAW 264.7細胞自噬而抑制OC分化，誘導由H2O2構建的OB和軟骨細胞氧化應激狀態下的自噬，以降低氧化應激水平，保護OB存活，抑制軟骨細胞增生[18]。

黃酮類成分槲皮素通過上調自噬相關基因LC3和Beclin1和凋亡相關基因caspase-3的表達，下調凋亡相關基因Bcl-2的表達，減輕雌激素缺乏誘導的OP[19]。山奈酚是一種廣泛存在于各種植物中的膳食生物類黃酮，對新生大鼠、GC誘導的OP模型、卵巢切除誘導的OP模型和骨折模型均有保骨作用，通過抑制脂肪生成、炎癥、氧化應激、破骨細胞自噬和成骨細胞凋亡，激活成骨細胞自噬，達到骨保護作用，自噬通路MAPK、mTOR參與其抗OP作用[18]。此外，一些黃酮類成分如高良姜素、淫羊藿苷Ⅱ、蘆丁等通過調控自噬以保護BMMSCs的生存并促進成骨細胞的分化[2]。

歐前胡素來源于白芷、防風等植物，可通過提高自噬水平恢復去勢大鼠BMMSCs向成骨分化的能力，治療PMOP[20]。鳶尾素可降低自噬底物p62水平，升高LC3B水平，通過激活自噬促進體外培養的老齡小鼠BMMSCs骨向分化的能力[21]。防己有效成分防己諾林堿可通過提高自噬相關蛋白ATG5和Beclin1增加自噬來預防GC誘導的OP大鼠骨質流失[22]。葛根的有效成分葛根素可通過激活AMPK/LC3信號通路或下調miR-204表達致LC3B表達增加上調自噬增強OB增殖和分化，還可通過Akt/mTOR通路誘導OC自噬。脫氫木香內酯通過下調整合素β3、蛋白激酶C-β和ATG5表達，抑制破骨細胞的遷移和溶酶體生物發生和分泌，從而抑制破骨細胞的活化[2]。香豆素衍生物蛇床子素在雌激素缺乏誘導的OP模型中通過上調自噬相關基因Beclin1和LC3的mRNA和蛋白表達水平誘導自噬，促進BMMSCs成骨分化[23]。此外，紫丁香苷通過上調LC3Ⅱ的表達誘導自噬促進成骨分化。益母草堿通過PI3K/Akt/mTOR通路激活自噬促進大鼠BMMSCs向成骨細胞分化。熊果苷通過上調地塞米松引起的自噬抑制改善小鼠GIOP。

3.中藥復方研究

(1)補腎壯骨方藥:二至丸(墨旱蓮、女貞子)可降低自噬相關基因mTOR、ATG5、Beclin1、p62表達從而抑制OC分化來改善GC所致的斑馬魚OP癥狀[24]。左歸丸和右歸丸(熟地黃、炒山藥、枸杞子、山茱萸等)均可升高去卵巢大鼠BMMSCs自噬水平[4]。滋陰補腎方(生龍骨、生牡蠣、桑寄生、續斷、淫羊藿、天花粉、黃連)通過上調Wnt/β-catenin信號通路顯著增加OB數量，增加骨量，治療糖尿病合并去卵巢OP大鼠[25]。

(2)補腎健脾方藥：培本固疏方(人參、鹿角片、龜板、仙桃草等)通過抑制卵巢切除OP大鼠自噬相關NF-κB通路抑制OC分化和成熟，并減少機體晚期糖基化終末產物的堆積抗氧化應激，進一步減少NF-κB的表達，從而增加骨密度，提高骨強度，改善骨代謝[26]。續苓健骨方(川續斷、白術、陳皮、赤芍、紅花、甘草等)治療卵巢切除所致大鼠OP模型過程中篩選差異miRNA的表達，發現自噬通路參與其作用[27]。

(3)補腎活血方藥：補正續骨丸(何首烏、自然銅、骨碎補、續斷等)通過調節自噬相關mTOR1信號通路糖體蛋白S6激酶1、真核細胞翻譯啟始因子4E蛋白的表達抑制骨吸收，從而對卵巢切除所致PMOP大鼠模型及OP性骨折有一定防治作用[28]。補腎通絡方能夠通過降低自噬相關基因ATG5、ATG7A的表達抑制破骨細胞分化，顯著改善潑尼松龍誘導的斑馬魚OP癥狀[29]。

(4)滋補肝腎方藥:抗疏強骨合劑(黃芪、熟地黃、淫羊藿、肉蓯蓉、菟絲子、當歸、丹參、三七、延胡索、白芍、骨碎補、牛膝、甘草)通過降低骨組織中自噬相關蛋白LC3Ⅱ、Beclin1的含量，抑制自噬達到治療去勢OP的作用[30]。

三、展 望

OP與中醫“骨痹”、“骨痿”癥狀相似，基于中醫“腎主骨”的理論，中醫藥主要通過補腎的方法防治OP，且能通過整體觀念對患者進行綜合治療，結合病證特點進行辨證施治，在防治 OP方面具有其獨特優勢。但對其治療機制的研究有待進一步加強，對自噬相關機制的研究更是從近幾年才開始的。自噬與中醫腎陰陽理論關系密切，在骨代謝以及BMMSCs、OB、OC、骨細胞的增殖、分化、代謝與生理功能行使中有重要的調控作用。自噬的過度或不足都會引起陰陽失衡，打破骨形成和骨吸收之間的平衡，不利于骨穩態和骨代謝，介導OP的發生和發展。但自噬在維持骨穩態過程中發揮正向還是負向的作用未有定論，治療過程中過度激活或抑制自噬可能對骨代謝產生不利影響，目前臨床尚無自噬調控藥物用于防治OP的評估，中藥的雙向調節作用可能會在維持自噬于適度水平的方面發揮作用，進而維持腎中陰陽的平衡以及骨重建平衡，調控自噬可能成為治療OP的新思路。