嗎替麥考酚酯治療小鼠間質性肺炎的作用及風險研究

何茳萍 黃 佼

肺部病變如肺間質病變、肺動脈高壓和繼發感染等是風濕免疫疾病最常見的系統表現之一[1]。免疫抑制劑如環磷酰胺(cyclophosphamide, CTX)、嗎替麥考酚酯(mycophenolate mofetil, MMF)是治療自身免疫相關肺間質血管病變的常用藥物，有臨床研究證實免疫抑制劑可有效改善肺功能和影像學表現，但是其在分子層面對肺部炎癥的作用目前未見研究報道[2，3]。有個例報道雷帕霉素及MMF可能導致肺泡蛋白沉積癥(pulmonary alveolar proteinosis, PAP)[4，5]。筆者前期在臨床工作中也曾診治過一例繼發于MMF的PAP患者，因此MMF誘發PAP的風險值得臨床關注。本研究通過體內實驗觀察不同濃度MMF灌藥對小鼠肺部病理結構、炎性因子表達、肺泡巨噬細胞數量以及粒巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)水平的作用。試圖探索MMF對于改善間質性肺病的作用以及明確是否具有引起肺泡蛋白沉積癥的潛在風險，為臨床中的精準用藥提供一定的依據。

材料與方法

1.主要試劑與儀器:小鼠IL-1β抗體、TNF-α抗體購自上海安迪生物科技有限公司，小鼠CD68抗體、β-actin抗體、TGF-β抗體購自上海艾博抗貿易有限公司，GM-CSF自身抗體及GM-CSF酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司，實時熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司?；瘜W發光成像儀購自美國通用生物系統公司，實時熒光定量PCR儀、多功能酶標儀購自美國賽默飛世爾科技公司，光學顯微鏡購自上海尼康儀器有限公司。

2.小鼠飼養及給藥:購買6～8周齡的SPF級雄性C57bL/6小鼠(n=18)，采用數字表法隨機分為3組(n=6),即PBS組、MMF1組和MMF2組。所有小鼠均予以5μg/g濃度的博來霉素滴鼻吸入。隨后PBS組予以等量PBS灌胃，MMF1組予以濃度為20mg/kg的MMF灌胃，MMF2組予以濃度為35mg/kg的MMF灌胃。3組小鼠均予以一天兩次灌藥，連續12周后，眼眶采血收集血清，后將小鼠安樂死，取肺組織。

3.HE染色及免疫組化：將肺組織用4%多聚甲醛固定至少24h，后續經過梯度乙醇脫水、石蠟包埋、連續切片、烤片、脫蠟等步驟，再分別進行HE染色和CD68免疫組化。應用光學顯微鏡觀察實驗結果，使用Image Pro Plus 6.0進行定量統計。

4.GM-CSF自身抗體與GM-CSF水平測定：收集所有小鼠血清，根據ELISA試劑盒說明依次通過上樣、加酶、溫浴、洗滌、顯色、終止等步驟，用酶標儀進行檢測，以空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(A)值，分析小鼠體內GM-CSF自身抗體水平以及GM-CSF水平的差異。

5.實時熒光定量PCR：將肺組織液氮冷凍勻漿，予以Trizol裂解提取總RNA，用Nanodrop測定其濃度。根據說明將RNA樣品反轉錄成cDNA，-20℃保存備用。反轉錄產物稀釋5～10倍后，根據TaKaRa SYBR green試劑盒的說明配置反應體系上機檢測，以GAPDH作為測定內參。PCR引物序列：mTGF-β：上游引物:5′-CCACCTGCAAGACCATCGAC-3′，下游引物:5′-CTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC-3′；m TNF-α：上游引物:5′-ATGTCTCAGCCTCTTCTCATTC-3′，下游引物：5′-GCTTGTCACTCGAATTTTGAGA-3′；mIL-1β：上游引物:5′-GAAATGCCACCTTTTGACAGTG-3′，下游引物:5′-TGGATGCTCTCATCAGGACAG-3′。

6.蛋白印跡法:小鼠肺組織液氮冷凍后勻漿，后置于RIPA蛋白裂解液冰上裂解5min，用超聲破碎儀冰浴處理組織使充分裂解，離心后分離上清，取少量樣品進行BCA蛋白定量，剩余樣品100℃煮沸5min，-20℃保存備用。制備SDS-PAGE凝膠，依次經過上樣、電泳、轉膜、封閉、4℃一抗孵育過夜、二抗孵育，通過化學發光顯影儀顯像，應用 Image J軟件對顯影條帶進行灰度定量分析。

結 果

1.MMF對博來霉素吸入后小鼠肺組織炎性因子表達的影響：MMF灌藥處理后發現，MMF可以顯著抑制小鼠肺組織炎性因子IL-1β、TNF-α和纖維化指標TGF-β的蛋白表達水平(F=9.30、20.30、18.03，P=0.000)和mRNA水平(F=37.30、23.76、40.90，P=0.000)。其中IL-1β、TGF-β在不同藥物劑量組間(MMF1、MMF2)比較，差異無統計學意義(t=0.10、2.45，P=0.93、0.06，圖1)。

圖1 不同濃度MMF灌藥對小鼠肺組織炎癥及纖維化相關分子蛋白水平的影響A.Western blot法檢測不同組間炎癥及纖維化相關分子蛋白表達的差異；B.定量PCR檢測不同組間炎癥及纖維化相關分子mRNA表達的差異; PBS.用PBS灌胃處理組;MMF1.用濃度為20mg/kg的MMF灌胃處理組;MMF2.用濃度為35mg/kg的MMF灌胃處理組。*P=0.000

2.MMF對博來霉素誘導小鼠肺部間質改變的影響:對小鼠肺組織進行HE染色，結果顯示博來霉素吸入可引起小鼠肺部炎性細胞浸潤和纖維化形成(黑箭頭)，而MMF灌藥處理后可顯著改善上述病理改變(圖2)。

圖2 HE染色檢測不同濃度MMF對小鼠肺部病理改變的影響(×40)A.PBS組;B.MMF1組;C.MMF2組;PBS組肺組織炎性細胞浸潤伴纖維化形成，提示間質性肺炎改變(黑箭頭)

3.MMF對小鼠肺泡巨噬細胞的數量的影響:通過免疫組化法對小鼠肺組織CD68進行檢測后發現，MMF1組和MMF2組小鼠肺組織中巨噬細胞數量較PBS組明顯減少(F=44.04,P=0.000)，而不同藥物濃度組間比較，差異無統計學意義(圖3)。

圖3 免疫組化檢測MMF對小鼠肺巨噬細胞數量的影響及相對定量(×5)A.PBS組；B.MMF1組；C.MMF2組；D.各組間CD68陽性吸光度值的相對結果；CD68標記巨噬細胞(黑箭頭)。* P=0.000

4.MMF對小鼠血清GM-CSF信號通路的影響:ELISA檢測結果顯示，MMF1組和MMF2組小鼠血清GM-CSF自身抗體及GM-CSF水平與PBS組比較，差異無統計學意義(F=0.49、0.66，P=0.62、0.53)，且均在正常水平(圖4)。

圖4 ELISA法檢測不同濃度MMF對小鼠血清GM-CSF水平(pg/ml)及GM-CSF自身抗體(μg/ml)的影響A.GM-CSF表達相對水平;B.GM-CSF自身抗體表達相對水平

討 論

免疫介導的肺部病變是風濕免疫科醫生都需要面對的難題，肺部的損害可能由多種原因引起，比如炎癥通路的異常激活、炎癥級聯反應、成纖維細胞的過度激活、血管內皮慢性炎癥損傷等，但具體機制仍不明確[6]。其病理改變主要呈非特異性間質性肺炎樣改變,機化性肺炎多與其他類型間質性肺炎合并存在[7]。以結締組織病相關間質性肺病為例，免疫抑制劑的應用是目前重要的治療手段，CTX和MMF均被大型RCT研究證實可有效改善肺部癥狀和影像學表現[8～10]。筆者從病理改變以及分子層面研究證實，MMF確實有改善博來霉素誘導的肺部炎性細胞浸潤以及纖維化形成的作用，并且可以抑制肺組織內炎性因子的表達水平，在分子層面佐證了MMF對于治療肺部炎癥和纖維化病變的有效性。

前期筆者在臨床工作中診治了1例接受MMF治療的混合性結締組織病患者，該患者在用藥半年后出現持續性咳嗽和進行性呼吸困難，肺泡灌洗證實PAP。PAP是一種罕見的肺部疾病，臨床表現為進行性呼吸困難、咳嗽和低氧血癥，肺部CT提示兩肺彌漫性滲出性改變，嚴重可致呼吸衰竭[11～13]。其典型的肺部病理改變是肺泡表面活性物質堆積，從而導致換氣功能障礙[14]。其發病機制尚不明確，考慮與肺泡巨噬細胞功能下降有關，目前習慣將其分為原發性、繼發性、先天性以及特發性4種[15，16]。原發性PAP是指由于GM-CSF信號通路異常導致肺泡巨噬細胞分化成熟障礙，通常是由于GM-CSF自身抗體的存在或者GM-CSF受體突變。繼發性PAP是指考慮因感染、腫瘤、血液系統疾病、免疫缺陷性疾病、藥物等因素引起的肺泡巨噬細胞功能障礙引起肺泡表面活性物質的堆積。先天性PAP是由于基因突變引起的表面活性物質生成紊亂，而特發性PAP指無明確病因或誘因的PAP。根據日本開展的一項大型的流行病學調查，原發性PAP和繼發性PAP分別占所有類型的92.0%和7.5%[17]。肺泡灌洗是常用的有效治療手段，但在繼發性PAP如藥物引起的病例中，及時停藥則較為關鍵[18]。

有研究顯示免疫抑制劑如西羅莫司和MMF可導致繼發性PAP，具體機制尚不明確，有假說推測是由于MMF抑制了細胞免疫從而阻礙了淋巴細胞依賴的巨噬細胞分化成熟過程以及巨噬細胞被招募的過程[19，20]。筆者研究報道的該例患者在停用MMF及多次肺泡灌洗后肺部病灶明顯吸收，臨床癥狀消失，ELISA檢測其血清GM-CSF自身抗體及GM-CSF水平均在正常范圍，因此考慮是由于服用MMF導致的繼發性PAP。盡管十分罕見，MMF導致PAP的潛在風險值得風濕科醫生的關注。本研究從小鼠體內實驗中證實MMF確實有減少肺泡巨噬細胞數量的作用，提示可能會因此與繼發性PAP的發生有一定的相關性，當然具體的因果關系有待于開展進一步研究證實。

綜上所述，本研究認為MMF是治療風濕免疫疾病相關肺間質病變的有效手段，但該藥物的應用會在一定程度上減少巨噬細胞數量，并可能會因此引起肺泡表面活性物質的堆積從而導致PAP的發生。這為筆者在前期臨床上碰到的病例的診斷與治療提供理論依據。當然，其藥物劑量、持續使用時間以及免疫系統疾病狀態與PAP發病明確的相關性則有待于進一步研究證實。