體外紫云英苷抑制小鼠BMM細胞向破骨分化

劉曉亮 朱振安

在人工關節(jié)置換領域中，骨吸收活動亢進而造成的假體周圍骨溶解、骨缺損是關節(jié)置換手術面臨的重要挑戰(zhàn)之一[1, 2]。而破骨細胞是維持骨吸收作用的主要細胞，因此如何通過抑制破骨細胞分化從而調(diào)節(jié)骨量穩(wěn)定是當前防治人工關節(jié)假體周圍骨溶解的研究重點。

紫云英苷(astragalin，C21H20O11，MW: 448.4g/mol)，是一種廣泛存在于植物中的類黃酮化合物。許多研究表明類黃酮化合物具有能夠促進成骨細胞分化、抑制骨關節(jié)內(nèi)的炎性反應、抑制破骨細胞分化等生理作用[3, 4]。以往的研究中，紫云英苷在骨關節(jié)系統(tǒng)中被驗證具有抑制骨關節(jié)炎、促進成骨分化的功效[5～7]。然而紫云英苷對破骨細胞分化的影響尚不得而知。因此，本研究通過使用核因子-κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB，RANKL)刺激C57BL/6小鼠的骨髓源巨噬細胞(bone marrow-derived macrophage, BMM)向破骨細胞分化，并以此為基礎研究了紫云英苷對小鼠BMM細胞向破骨細胞分化的影響。

材料與方法

1.實驗試劑：CCK-8試劑盒購自日本Dojindo Molecular Technology公司，細胞因子M-CSF、RANKL購自美國R&D Systems公司，TRAP染色試劑盒、鬼筆環(huán)肽、DAPI熒光染液購自美國Sigma-Aldrich公司，紫云英苷(No.MB7087)購自大連美侖生物技術有限公司，Real-time PCR 試劑盒與RT-PCR反轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司，TRAP、NFATc1、CTSK、GAPDH引物購自生工生物(上海)股份有限公司。

2.實驗動物：4～6周齡雄性C57BL/6 小鼠，購自上海市實驗動物中心西普爾-必凱實驗動物有限公司[生產(chǎn)許可：SCXK(滬)2013-0016；使用許可：SYXK(滬)2018-0026]。無特定病原環(huán)境下飼養(yǎng)。飼養(yǎng)規(guī)范遵循上海生命科學院實驗動物指南及上海交通大學醫(yī)學院相關規(guī)定執(zhí)行。

3.細胞收集與培養(yǎng)：取4～6周齡的小鼠，處死后使用75%的乙醇溶液浸泡小鼠全身消毒20min。分離出小鼠的股骨與脛骨，使用細胞培養(yǎng)基反復沖洗股骨脛骨的髓腔。將沖洗得到的骨髓細胞與培養(yǎng)基混合液使用篩網(wǎng)過濾，離心后使用15ml含30ng/ml M-CSF的培養(yǎng)基重懸細胞，并接種于T75培養(yǎng)瓶中，37℃、飽和濕度、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。48h后使用含30ng/ml M-CSF的培養(yǎng)基換液并棄去未貼壁的細胞與殘留的小鼠軟組織，即得原代BMM細胞。

4.CCK-8檢測：將BMM細胞以1×104個/孔的密度種植于96孔板中，在孔中加入含不同濃度梯度的紫云英苷的培養(yǎng)基(0、12.5、25、50、100、200、400、800μmol/L)進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h之后，在每個孔內(nèi)換入含10μl CCK-8試劑的100μl培養(yǎng)基，并放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2h，之后使用吸光度酶標儀以650nm為參照，在450nm波長下測定孔內(nèi)的吸光度(A)。

5.抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase， TRAP)染色：將獲取的BMM細胞加入胰酶消化并重懸后，以8×103個/孔的濃度接種至96孔板中，在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。配置含RANKL與不同濃度紫云英苷的培養(yǎng)基(0、50、100、200μmol/L)，培養(yǎng)5天后進行鏡下觀察，當發(fā)現(xiàn)空白組細胞融合為多核巨細胞時使用TRAP染色試劑盒進行染色。將96孔板內(nèi)的細胞培養(yǎng)基吸取出，并用PBS溶液小心洗滌孔內(nèi)的細胞3遍；之后使用移液槍吸取50μl 4%多聚甲醛，滴入96孔板內(nèi)，固定細胞20min；20min后吸取并棄去固定液，再次使用PBS清洗孔內(nèi)細胞，待培養(yǎng)孔風干干燥后；將配置好的TRAP工作液200μl滴入孔內(nèi)，在避光的條件下37℃恒溫孵育2h；2h后使用移液槍吸取工作液，再次使用PBS清洗板孔；使用光學顯微鏡觀察細胞胞質(zhì)區(qū)，觀察到的紅色團塊即為TRAP陽性的破骨細胞。

6.F-actin環(huán)熒光染色：取96孔板孔徑大小的牛骨片，使用75%乙醇溶液浸泡并使用紫外照射牛骨片正反面2h消毒，使用雙抗洗滌后浸泡入無血清培養(yǎng)基內(nèi)備用。將獲取的牛骨片平鋪在96孔板孔底部，將BMM細胞收集后種植于96孔板內(nèi)，等待其附著于牛骨片上，加入對應培養(yǎng)基培養(yǎng)，當光鏡下觀察到無骨片的孔內(nèi)出現(xiàn)破骨細胞時，再培養(yǎng)1天后將牛骨片取出，以備后續(xù)觀測。骨片取出后使用無菌PBS溶液清洗，每次10min，重復3次，之后使用4%多聚甲醛固定骨片10min，羅丹明鬼筆環(huán)肽染液于避光處進行熒光染色30min，染色結束后使用DAPI染液染色5min，最后使用激光共聚焦顯微鏡進行攝片觀察。

7.實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR) 檢測：將收集得到的BMM細胞以1×105個/孔的密度種植于6孔板中，加入含有濃度梯度的紫云英苷破骨細胞誘導培養(yǎng)基(M-CSF 30ng/ml，RANKL 50ng/ml)，在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5天，提取總RNA。6孔板每孔加入350μl裂解液和350μl 70%乙醇，使用1ml移液槍吹打混勻后移至紅色柱內(nèi)；多次離心后棄去柱子下部液體；更換下面的柱子，將剩余柱子放入1.5ml的EP管內(nèi)，加入30μl的DEPC水；最后4℃ 12000r/min下離心1min，在1.5ml EP管內(nèi)收集得到總RNA。使用反轉錄試劑盒進行反轉錄反應(37℃ 15min； 70℃ 10min)，得到cDNA。使用得到的cDNA與破骨分化基因引物(TRAP, CTSK, NFATc1)進行聚合酶鏈式反應。相關引物序列如下：TRAP：上游引物: 5′-TGGATTCATGGGTGGTGCTG-3′，下游引物:5′-AGCCACAAATCTCAGGGTGG-3′；CTSK：上游引物:5′-CACCCTTAGTCTTCCGCTCA-3′，下游引物:5′-CTTGAACACCCACATCCTGCT-3′；NFATc1：上游引物:5′-CATGCGAGCCATCATCGACT-3′，下游引物:5′-AGTTATGGCCAGACAGCACC-3′；GAPDH：上游引物:5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游引物:5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。

8.統(tǒng)計學方法：采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，通過兩樣本t檢驗進行兩組間數(shù)據(jù)分析，以P<0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.紫云英苷對BMM細胞無明顯細胞毒性:CCK-8檢測結果表明紫云英苷僅在高濃度時(400、800μmol/L)對BMM細胞的增殖出現(xiàn)了明顯的抑制作用(P<0.01)。而實驗中常規(guī)使用的紫云英苷濃度為100μmol/L，因此紫云英苷的使用不會對BMM細胞產(chǎn)生細胞毒性，也不會對紫云英苷在破骨細胞分化方面的研究產(chǎn)生干擾(圖1A)。

圖1 不同濃度的紫云英苷對小鼠BMM細胞的毒性作用與TRAP染色A.小鼠BMM細胞的CCK-8活性檢測(相對于0μmol/L組)；B.每孔內(nèi)TRAP陽性破骨細胞計數(shù)；C.TRAP陽性破骨細胞染色(×400)。與0μmol/L組比較，*P<0.01

2.紫云英苷體外抑制TRAP陽性細胞形成：BMM細胞在RANKL的作用下能夠分化為破骨細胞，然而在紫云英苷的作用下，BMM誘導分化為破骨細胞的作用被抑制，50μmol/L的紫云英苷將BMM分化的破骨細胞數(shù)量顯著降低(P<0.01，圖1B)，而在200μmol/L下過半的BMM的破骨分化都被抑制(圖1B)，破骨細胞的數(shù)量在200μmol/L作用下顯著減少(P<0.01)。紫云英苷不僅在低濃度時對破骨細胞分化有抑制作用，在高濃度下(200μmol/L)紫云英苷的抑制作用顯著增強，TRAP陽性的細胞數(shù)量顯著下降(P<0.01，圖1)。

3.紫云英苷抑制F-actin環(huán)形成：在RANKL的作用下，骨片上形成了大量的F-actin環(huán)(圖2A)，證明RANKL誘導了破骨細胞的分化與骨吸收活動。在紫云英苷的作用下，F(xiàn)-actin環(huán)的數(shù)量顯著下降(P<0.01，圖2B)，同時F-actin環(huán)的面積也相應減小(圖2C)，且減少的幅度均與紫云英苷的濃度呈正相關。

圖2 不同濃度的紫云英苷處理下小鼠BMM形成的F-actin環(huán)A.F-actin環(huán)共聚焦熒光圖(羅丹明鬼筆環(huán)肽 DAPI，×400)；B.每孔F-actin環(huán)數(shù)；C.每孔相對F-actin環(huán)面積。與0μmol/L組比較，*P<0.01

4.紫云英苷抑制破骨分化基因表達：qPCR結果顯示在RANKL的作用下，BMM細胞中成功檢測到了破骨分化相關的基因表達，RANKL成功誘導了BMM細胞向破骨細胞的分化。同時，在紫云英苷的作用下，破骨細胞相關基因的表達相對于0μmol/L均下降(圖3)， 并且降低的效果呈現(xiàn)出濃度相關性，在低濃度時(50μmol/L)對破骨分化的抑制效果較低，下降的相對幅度不如100、200μmol/L組明顯，而在高濃度下(200μmol/L)紫云英苷對破骨相關基因表達的降低效果更加顯著(P<0.01)。

圖3 RT-PCR檢測破骨分化相關基因的表達A.TRAP；B.CTSK;C.NFATc1。與0μmol/L組比較，*P<0.05，**P<0.01

討 論

破骨細胞的異常激活造成骨吸收作用的亢進，破骨細胞分化活動在多種疾病中具有著重要作用[8,9]。類黃酮化合物對破骨細胞分化活動的抑制在多項研究中被報道，紫云英苷作為黃酮醇苷類化合物，具有潛在的抑制破骨細胞分化、維持骨量穩(wěn)定的能力，研究紫云英苷化合物對破骨細胞分化的影響有利于發(fā)掘治療的新方案[4,10,11]。

本實驗使用C57BL/6小鼠提取具有破骨細胞分化潛力的小鼠BMM細胞，使用RANKL誘導小鼠BMM向破骨細胞分化，并進一步使用紫云英苷研究其對破骨細胞分化的影響。CCK-8實驗顯示紫云英苷具有良好的生物相容性，對小鼠BMM細胞沒有明顯的細胞毒性，在TRAP染色中，紫云英苷顯著抑制了TRAP陽性細胞的數(shù)目，TRAP陽性為破骨細胞分化的標志，顯示紫云英苷抑制了RANKL誘導的破骨細胞分化。之后通過進一步的RT-PCR檢測破骨相關基因TRAP、NFATc1、CTSK的表達，驗證了基因層面上紫云英苷對破骨細胞分化的抑制作用。綜合以上實驗從體外的角度驗證了紫云英苷抑制破骨細胞分化的作用。

破骨細胞的分化與多種因素有關，與多種細胞與信號通路有聯(lián)系，破骨細胞的增殖與分化受細胞因子M-CSF和RANKL的調(diào)控[12]。傳統(tǒng)的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路與核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)通路是RANKL破骨分化信號轉導的主要信號通路[13～15]。同時它們也是介導多種外部刺激與炎性反應的重要通路，破骨細胞的激活還與RANKL-RANK-OPG系統(tǒng)的平衡有關[16]。RANK表達于單核-吞噬細胞表面，在破骨細胞前體細胞中高度表達，RANKL與RANK的結合是破骨細胞分化的重要核心，而OPG與RANK競爭性結合RANKL位點從而調(diào)控破骨細胞的分化[8, 9]。紫云英苷抑制破骨細胞分化的機制及與其他信號通路之間的作用仍亟待開展進一步的研究，期待為未來骨關節(jié)疾病的預后與治療帶來新的思路。