基于基線等比增減設計法優選牛膝白芍對帕金森病肝陽上亢證小鼠神經保護作用的最佳配比研究

張靜艷 郭科東 金 明 榮 華 張曉杰

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是中老年人群常見的神經系統退行性疾病，以肌肉強直、靜止性震顫等癥狀為主要臨床表現，其發生率逐年上升，嚴重威脅人類健康[1]。PD的治療目前以外源性補充多巴胺(dopamine，DA)為主，雖然能夠改善疾病的癥狀，但由于缺乏神經保護作用，不能阻止神經元的變性、疾病進展及致殘。因此需要進一步研究有效治療PD的潛在新療法[2，3]。

鎮肝熄風湯記載于《醫學衷中參西錄》,臨床用于肝腎陰虧、肝陽上亢型PD療效顯著[4]。但大復方藥味復雜，不同成分疊加后的作用難以預測。牛膝與白芍是鎮肝熄風湯的核心藥對，是治療帕金森病方劑中出現頻率較高的單味中藥，且筆者課題組前期細胞實驗已經證實，牛膝與白芍有效組分配伍對PD多巴胺能神經元具有協同保護作用，但其配伍的體內研究尚未有報道[5，6]。本實驗提取鎮肝熄風湯的君藥牛膝和臣藥白芍為核心藥對，以基線等比增減設計法為基礎，牛膝與白芍2∶1為基線向兩側擴展，直至擴大到極點(0∶4、4∶0)，最后形成牛膝與白芍 0∶4、1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1、4∶0配比組，探索其在體內發揮神經保護作用的最佳配伍比例[7]。

材料與方法

1.實驗材料：8周齡C57BL/6雄性小鼠90只，體質量為22±2g，由維通利華(北京)實驗動物科技有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0006。附子(D4120201)購自黃岡金貴中藥發展有限公司，懷牛膝(801000130)、白芍(801001062)均購自北京同仁堂飲片有限公司，分別以相應比例混合。所有藥材按傳統煎藥法制成含生藥附子0.2g/ml、牛膝白芍0.5g/ml藥液。MPTP(M 0896)購自美國Sigma公司，兔抗鼠TH抗體(2792S)購自美國CST公司,β-actin抗體(4967S)購自美國CST公司，羊抗兔IgG抗體(BA1054)購自武漢博士德生物工程公司。

2.動物分組、造模及給藥：小鼠采用數字表法隨機分為對照組、模型組、牛膝白芍不同配比組，共9組，每組10只。除對照組外，各組小鼠給予附子湯[3g/(kg·d)]灌胃4周制備肝陽上亢證動物模型[8]。灌胃結束后，牛膝白芍不同配比組連續14天灌胃相應比例藥物[6.5g/(kg·d)，按小鼠平均體質量23g計算即每天每只小鼠給藥量為150mg]，對照組、模型組給予等體積蒸餾水。于給予治療藥物第10天開始，模型組、牛膝白芍不同配比組小鼠腹腔注射MPTP[30mg/(kg·d)]連續5天制備PD肝陽上亢證結合模型[9]。灌胃及腹腔注射過程中死亡的小鼠直接予以剔除。

3.小鼠易激惹程度觀察及評分：Ⅰ級：捉持小鼠頭頸時出現尖叫、驚跳；Ⅱ級：捉持小鼠頭頸時咬人；Ⅲ級：小鼠被提尾時尖叫、驚跳或與同籠小鼠廝斗。Ⅰ～Ⅲ級均不出現者為0級，實驗結束前測量1次[10]。

4.轉棒實驗檢測小鼠協調平衡能力：轉棒儀起始轉速為4r/min，最大轉速為40r/min，加速度為0.12r/min，測試時間為5min，記錄小鼠在轉棒上停留的時間，即掉落潛伏期[11]。

6.免疫組化法分析TH陽性神經元平均光密度：黑質區石蠟包埋切片，進行脫蠟、抗原修復、封閉。PBS漂洗后滴加按1∶200稀釋的TH一抗。PBS清洗后滴加二抗(1∶100),進行DAB顯色，蘇木精復染,PBS返藍，脫水封片。使用Image-Pro Plus 6.0軟件測定TH陽性蛋白的表達,根據其累積吸光度計算各組的平均吸光度(MOD)。

7.Western blot法檢測黑質TH蛋白表達：冰上取鼠腦黑質，BCA法進行蛋白定量，SDS凝膠電泳，轉膜，封閉，加入TH抗體(1∶1000)4℃過夜；二抗(1∶6000)孵育；TBST清洗后進行ECL化學發光反應，凝膠成像系統顯影，并用AlphaEase FC圖像分析軟件對免疫印跡條帶進行密度掃描，以TH/β-actin比較各組蛋白相對表達水平。

結 果

1.小鼠易激惹程度的比較:與對照組比較，模型組小鼠易激惹程度明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，牛膝白芍1∶4、1∶2、1∶1、2∶1組小鼠易激惹程度明顯降低(P<0.05)，而牛膝白芍0∶4、4∶1、4∶0組小鼠易激惹程度差異無統計學意義(P>0.05，表1)。

表1 小鼠易激惹程度的比較

2.小鼠轉棒掉落潛伏期的比較:與對照組比較，模型組小鼠掉落潛伏期明顯縮短(P<0.05)；與模型組比較，牛膝白芍各配比組小鼠掉落潛伏期明顯延長(P<0.05，表2)。

表2 小鼠轉棒掉落潛伏期的比較

3.聯合指數法對牛膝與白芍聯用協同作用的分析:等效線圖顯示所有配比組聯合用藥數據點均在等效線下方，CI值均<1，提示兩藥在不同比例配伍時均具有協同增效作用。其中在牛膝與白芍以1∶2比例配伍時，聯合指數(CI=0.860)最小，效應值(Fa=0.235)最大，即協同增效作用最佳(圖1、表3)。

圖1 牛膝白芍不同配比等效線圖1.牛膝白芍1∶4組；2.牛膝白芍1∶2組；3.牛膝白芍1∶1組；4.牛膝白芍2∶1組；5.牛膝白芍4∶1組

表3 牛膝白芍不同配比聯合指數及效應值

4.小鼠TH免疫組化結果比較:與對照組比較，模型組小鼠黑質TH平均吸光度值顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，牛膝白芍各配比組黑質TH平均吸光度值均明顯增高(P<0.05或P<0.01)，而其中以牛膝白芍1∶2組增高更為明顯(P<0.01，圖2、表4)。

圖2 各組小鼠TH表達水平(免疫組化法，×400)A.對照組;B.模型組;C.牛膝白芍0∶4組;D.牛膝白芍1∶4組;E.牛膝白芍1∶2組;F.牛膝白芍1∶1組;G.牛膝白芍2∶1組;H.牛膝白芍4∶1組;I.牛膝白芍4∶0組

表4 各組小鼠黑質TH平均吸光度比較

5.小鼠腦組織TH蛋白相對表達量的比較:與對照組比較，模型組小鼠黑質TH蛋白表達明顯減少(P<0.01)；與模型組比較，牛膝白芍不同配比組小鼠黑質TH蛋白表達均明顯增加(P<0.05)，而其中以1∶2組蛋白表達增加更為明顯(P<0.01，圖3)。

圖3 各組小鼠腦組織TH蛋白相對表達水平A.TH免疫印跡圖；B.TH統計直方圖。與對照組比較,*P<0.01；與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01

討 論

PD發病的根本原因為黑質DA能神經元的進行性缺失，DA類藥物替代療法仍是西醫臨床常用的治療手段。由于神經退行性疾病的治療藥物多具有一定的毒性及不良反應，中醫藥對PD的研究越來越受到廣泛關注[14]。牛膝白芍是臨床治療帕金森病幾十余首方劑的常用配伍藥對，牛膝補益肝腎、引火下行，白芍滋陰生津、緩急止痙[15,16]。兩藥配伍，補腎柔肝，潛陽熄風。鑒于中藥大復方藥味的復雜性，藥對的比例及作用難以在方劑中研究與確定，本實驗在前期體外研究的基礎上，設計牛膝與白芍的不同配比，探討其在體內發揮神經保護作用的最佳配伍比例。

動物實驗證實，附子煎液灌服可制備PD肝陽上亢證模型[8]。附子辛溫大熱，久用耗傷精血，致肝腎陰虛、肝氣上逆于腦，故鼠出現煩躁易怒(易激惹)癥狀。MPTP是PD研究中常用的神經毒素，可選擇性損傷DA能神經元并誘導動物出現震顫、行動遲緩等行為[17]。本實驗采用附子煎液灌服結合MPTP腹腔注射復制PD肝陽上亢證小鼠模型,小鼠激惹程度明顯增高，并且出現弓背、抽搐、肌肉強直等癥狀，說明人類肝陽上亢型PD的癥狀在本實驗中得到了較好的模擬。

易激惹實驗結果表明，牛膝白芍1∶4、1∶2、1∶1、2∶1組小鼠易激惹程度較模型組明顯降低，表明牛膝白芍兩藥以該比例配伍可使PD小鼠肝陽上亢癥狀得到較好的緩解。轉棒實驗結果表明，牛膝白芍各配比組小鼠掉落潛伏期均較模型組明顯增加，表明牛膝白芍不同比例配伍均可使PD肝陽上亢證小鼠運動協調能力的損傷得到緩解。由于運動障礙是帕金森病的主要臨床表現，本實驗采用轉棒行為學數據，應用Compusyn軟件分析牛膝白芍不同比例配伍的聯合作用。結果表明，牛膝白芍各比例配伍均具有協同作用，1∶2為其協同增效作用的最佳比例。

TH是腦內DA能神經元的特異性標志蛋白，其含量間接反映DA能神經元的損傷情況[18]。免疫組化及Western blot法實驗檢測結果顯示，牛膝白芍各配比組TH陽性神經元及蛋白表達均較模型組明顯增加，說明其可以有效減輕神經毒素對小鼠黑質DA能神經元造成的損傷，發揮神經保護作用，且以1∶2比例配伍時這種神經保護作用更加明顯，這與由行為學實驗計算的聯合指數最佳配伍比例結果相一致。

綜上所述，牛膝與白芍兩藥聯用對PD肝陽上亢證小鼠DA能神經元具有協同增效的神經保護作用，1∶2為最佳配伍比例。筆者后續重點將圍繞兩藥配伍后協同增效作用的機制展開研究，為其指導臨床用藥、精簡復方提供更多的實驗依據。