miRNA-451/MIF在帕金森病小鼠認知功能障礙中的保護作用

陳嘉寧 李 尤 高玉元 聶 坤 王麗娟

帕金森病(Parkinson′s disease, PD)，目前是僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)的第二大神經退行性疾病。然而，除了典型的三大運動癥狀——運動遲緩、肌肉強直和靜止性震顫外，PD的非運動癥狀也會嚴重影響患者的生活質量，其中認知功能障礙(cognitive impairment, CI)發生率高，且嚴重影響患者生活質量[1～3]。帕金森病認知功能障礙(PD-CI)分為帕金森病輕度認知功能障礙及帕金森病癡呆。本課題組前期研究發現，在PD體外模型中過表達巨噬細胞游走抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)可以保護多巴胺能神經元，并且減少神經元神經炎癥，而AD小鼠模型中敲除MIF會損傷小鼠認知功能，提示MIF可能參與PD甚至PD-CI的疾病過程[4，5]。miRNA-451作為MIF表達的上游通路，負性調控MIF表達[6，7]。研究發現，與健康對照比較，PD-MCI和帕金森病不伴認知障礙患者血清中的miRNA-451表達上調，但miRNA-451/MIF通路在PD-CI中的具體作用和機制尚不明確[8]。本研究通過體內干預PD小鼠模型腦組織中miRNA-451表達，以探究miRNA-451/MIF通路在PD-CI中的作用。

材料與方法

1.動物與耗材、試劑：SPF級C57BL/6小鼠共56只，6～8周齡，體質量約25～30g，由南方醫科大學動物實驗中心提供。本實驗已通過動物倫理審批(倫理號：GDREC2016095A)。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)購自美國西格瑪奧德里奇公司；miRNA-451 antagomir和miR-451 antagomir control購自廣州銳博生物有限公司；酪氨酸羥化酶(TH)抗體購自德國默克密理博公司；微型手持顱鉆、桌面數顯腦立體定位儀、單通道微量注射泵購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。

2.實驗動物的分組及疾病模型的構建：本研究采用亞急性帕金森病小鼠模型。將小鼠分為6組，分別為正常對照組(control組，n=14)、陰性對照組(NC組，n=6)、MPTP組(n=12)、假手術組(sham組，n=8)、miRNA-451 antagomir組(miR-in組，n=8)和miRNA-451 antagomir control組(miR-con組，n=8)。參考Gibrat等[9]的研究，對MPTP組、sham組、miR-in組和miR-con組腹腔注射MPTP，每天注射劑量為25mg/kg，連續注射7天。control組不做任何處理，NC組腹腔注射等劑量的0.9%氯化鈉溶液。sham組、miR-in組和miR-con組皆在第1次腹腔注射MPTP后當天，進行側腦室立體定向注射，共注射1次。注射方法：將小鼠固定在小鼠腦立體定位儀上，暴露顱骨前囟，根據腦圖譜在側腦室區(AP：-0.3mm，ML：-1mm，DV：-2.5mm)鉆孔，注射流量為0.5μl/min，共注射10min。sham組注射5μl的滅菌0.9%氯化鈉溶液，miR-in組注射miRNA-451 antagomir(1nmol/μl，共5μl)，miR-con組注射miRNA-451 antagomir control(1nmol/μl，共5μl)。

3.小鼠認知功能評估：末次腹腔注射MPTP后第14天進行Morris水迷宮評估小鼠的認知功能。Morris水迷宮為一圓形、白色池底的水池，直徑100cm，高50cm，水深30cm，水溫保持在23±2℃。在水池壁上均勻選取4個點作為起始點，將水池平均地分為4個象限。準備另一白色平臺，置于第三象限使平臺與池壁圓心距離相等，平臺直徑12cm，高29cm，高度在水下1cm，使平臺不可見。實驗分為定向航行實驗和空間探索實驗。(1)定向航行實驗：將小鼠順時針依次延第一、二、三、四象限池壁的正中位置、面向池壁輕輕放入水中，記錄60s內小鼠尋找平臺的活動。如果小鼠找到平臺的時間<60s，則該時間即為小鼠的逃逸潛伏期；如小鼠找到平臺的時間≥60s，則將逃逸潛伏期記錄為60s。實驗持續3天。逃逸潛伏期的長短可用于評價小鼠空間學習能力。(2)空間探索實驗：定向航行實驗結束后第2天，將第三象限平臺撤去，進行空間探索實驗。將小鼠于第一象限池壁正中、面向池壁輕輕放入水中，記錄小鼠60s內在原平臺象限游泳時間，可用于評價小鼠空間記憶儲存及提取再現的能力。

4.免疫組織化學檢測：行為學檢測后當天將小鼠斷頸、處死、取腦，將全腦組織固定、脫水、浸蠟、包埋等，制備組織蠟塊，進行黑質區冠狀位石蠟切片，每組取相同位置切片，進行脫蠟、脫水、熱修復，過氧化氫孵育，封閉液封閉1h，滴加TH抗體(1∶100)后4℃孵育過夜，用合適的二抗室溫孵育1h，滴加DAB顯色后PBS沖洗，遞增梯度乙醇脫水，二甲苯固定后封片，顯微鏡觀察。用Image-Pro Plus 6.0.0.260分析，比較各組黑質區TH染色的平均吸光度值[MOD，MOD(%)=積分吸光度值(IOD)/面積(area)×100%]。

5.尼氏染色：切片前步驟同免疫組化。石蠟切片脫蠟水化后，在室溫條件將切片浸入1%焦油紫水溶液中浸沒約5～10min(視溫度和各切片情況而定)。取出切片，蒸餾水沖洗10～20min，95%乙醇分色，鏡檢至神經元尼氏體清晰。同免疫組化遞增梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

6.qRT-PCR檢測miRNA-451及MIF mRNA的表達：行為學檢測后當天將小鼠斷頸、處死、取腦，加入Trizol裂解液，經氯仿-異丙醇體系提取腦組織總mRNA，反轉錄合成相應的cDNA后進行qRT-PCR檢測。以U6為內參，采用2-ΔΔct法計算miRAN-451的相對表達量[10]；以GAPDH為內參，采用2-ΔΔct法計算MIF mRNA的相對表達量。

結 果

1.miRNA-451在不同認知功能的PD小鼠模型中的表達差異：連續3天的定向航行訓練中，MPTP組根據第3天定向航行訓練的潛伏期長短遞增排序，潛伏期較短的前6只小鼠為MPTP-1組，后6只為MPTP-2組。在第3天control組與NC組都表現出了空間學習能力，而腹腔注射MPTP組潛伏期較control組、NC組明顯延長(P<0.01)，其中，MPTP-2組較MPTP-1組潛伏期曲線更為平緩(圖1A)。空間探索實驗結果提示，腹腔注射MPTP組在原平臺象限游泳的時間較control組顯著減少(P<0.05，圖1B)。由于MPTP耗竭小鼠黑質紋狀體的多巴胺能細胞會引起運動遲緩或姿勢不穩，對小鼠的運動能力和游泳速度有影響從而影響潛伏期結果，因此筆者比較了第3天定向航行實驗過程中各組小鼠游泳時的最大速度，差異無統計學意義(P>0.05，圖1C)。

圖1 小鼠Morris水迷宮結果A.小鼠平均潛伏期變化曲線，與control組比較，*P<0.01，**P=0.000；與NC組比較，#P<0.05，##P<0.01；B.小鼠空間探索實驗在原平臺象限時間；C.小鼠最大游泳速度比較

免疫組化對各組小鼠黑質區進行TH染色提示，MPTP腹腔注射會引起小鼠黑質區多巴胺能神經元細胞減少，其中MPTP-2組小鼠比MPTP-1組更少(P<0.01，圖2中A、B)；qPCR結果表明，PD組小鼠腦組織miRNA-451表達增多(P<0.01)，且MPTP-2組小鼠腦組織中miRNA-451表達較MPTP-1組增多，差異有統計學意義(P<0.05，圖2C)。

圖2 各組小鼠中腦黑質部TH染色及miRNA-451表達A.小鼠黑質部酪氨酸羥化酶(TH)免疫組化染色結果(×1000)；B.TH免疫組化染色平均吸光度；C.小鼠腦組織miRNA-451表達qPCR結果

2.miRNA-451表達水平變化對PD小鼠認知功能的影響：qRT-PCR檢測結果表明，與sham組比較，側腦室立體定向注射miRNA-451 antagomir會降低MPTP腹腔注射小鼠腦組織內miRNA-451表達，差異有統計學意義(P<0.01，圖3A)，增加下游分子MIF mRNA的表達(P<0.01，圖3B)，并且可以緩解腹腔注射MPTP所致的認知功能的受損(P<0.05，圖4中A、B)，且結果不受小鼠運動能力和游泳速度的影響(圖4C)。

圖3 各組小鼠腦組織miRNA-451及MIF表達A.miRNA-451表達；B.MIF mRNA表達

圖4 小鼠Morris水迷宮結果A.平均潛伏期變化曲線，與miR-in組比較，*P<0.05；與control組比較，#P<0.05；B.小鼠空間探索實驗原平臺區域時間；C.小鼠最大游泳速度比較

免疫組化對各組小鼠黑質區進行TH染色(圖5)，sham組TH的MOD值較control組減少，差異有統計學意義(P<0.01)，而miR-in組MOD值明顯比sham組和miR-con組高，差異有統計學意義(P<0.01)。

圖5 各組小鼠中腦黑質部TH染色結果A.小鼠黑質部酪氨酸羥化酶(TH)免疫組化染色結果(×500)；B.酪氮酸羥化酶(TH)免疫組化染色平均吸光度

3.miRNA-451表達水平變化對PD小鼠海馬的影響：對各組小鼠海馬CA3區進行尼氏染色(圖6)可見，control組神經元排列均勻，形態規整，尼氏小體清晰可見。miR-in組神經元排列較均勻，稍有紊亂，細胞形態歸整，但尼氏小體較少，染色稍淺。sham組神經細胞有少量的神經細胞脫失，細胞間隙增大，排列稍有松散，未見尼氏小體。miR-con組神經元胞體腫脹明顯，尼氏體稍淡染，細胞間隙增大，神經元部分排列紊亂、稀疏，細胞間隙增寬，且整體著色較淡。miR-in組受損較sham組與miR-con組輕。

圖6 各組小鼠海馬CA3區尼氏染色情況比較(×1000)A.control組；B.sham組；C.miR-in組；D.miR-con組

討 論

帕金森病患者除了典型的運動癥狀外，在疾病早期即可出現認知功能障礙，并且先于運動癥狀的出現[11，12]。目前關于PD-CI的發生機制言論不一，目前主要認為與神經病理改變和神經化學遞質改變相關，病理改變主要涉及蛋白錯誤折疊、神經炎癥、小膠質和星形膠質細胞改變等，神經化學遞質改變則主要與多巴胺和乙酰膽堿相關[13]。本研究發現的認知改善可能由于下調miRNA-451后，增加了MIF的表達，從而產生了對多巴胺能神經元和海馬區細胞的保護作用。

miRNA屬于非編碼RNA，與mRNA結合后可以使其降解或抑制其翻譯過程，調控細胞代謝活動，許多miRNA可直接或間接調控與PD相關的基因或分子[14，15]。miRNA-451首次在人垂體中被發現，參與多種生理過程，其表達水平上調可以在體外增加膠質瘤細胞的凋亡，下調miRNA-451可以通過激活AMPK途徑產生促進細胞生存的作用，保護內皮細胞在糖氧剝奪條件下的程序性壞死[16，17]。在癲癇小鼠模型中下調miRNA-451可以保護海馬神經元細胞的凋亡，增加膠質細胞源性神經營養因子，減輕癲癇發作對腦組織的損傷[18]。而其在PD及PD認知障礙中的作用及機制鮮有報道，本課題組前期研究發現miRNA-451的升高可能參與PD甚至PD認知障礙的發生及發展[8]。

本研究結果發現，miRNA-451在PD模型小鼠中表達增加，且伴有認知障礙的小鼠中增加更明顯，結合既往研究結果，認為可能與miRNA-451的抑制生長、促進凋亡作用相關。miRNA作為一種調控手段，行使生物功能還需依賴下游的分子蛋白。其中MIF受miRNA-451的負性調控，廣泛表達于各種細胞。筆者前期研究發現，在PD體外模型中過表達MIF可以通過增加線粒體膜電位而抑制神經元細胞的凋亡，并且減少神經炎癥[4]。

Aβ淀粉樣蛋白會引起神經元細胞分泌MIF，且MIF分泌增加可以保護神經元免受Aβ誘導的細胞毒性作用，可能因其可以抑制p53的激活，從而減少Aβ誘導的神經元細胞凋亡[5，19]。由于MPTP也可通過激活p53引起細胞凋亡，本研究下調miRNA-451引起MIF表達增加后，可能通過抑制該通路而減少了多巴胺能神經元和海馬區神經元的凋亡，起到保護作用[20]。此外，由于神經炎癥也是PD及PD-CI的發病機制之一，抑制神經炎癥也是治療PD及PD-CI的策略之一。有研究發現，MIF在視網膜神經節細胞中可以抑制小膠質細胞的活化，可以減少小膠質細胞TNF-α的表達，說明MIF表達增加可以緩解神經炎癥起到保護作用，這可能也是本研究中PD小鼠認知障礙得以改善的原因之一[21，22]。

綜上所述，miRNA-451/MIF通路與PD及PD-CI的發生和發展密切相關，靶向下調miRNA-451或上調MIF表達可能對PD及PD-CI有保護作用，可以為PD及PD-CI的治療提供新的思路和方法，而其具體機制仍需進一步研究。