CD4+T細胞分泌細胞因子對骨偶聯的影響

李芳瑜 劉曉輝 崔 舜

骨偶聯是指破骨細胞介導的骨吸收與成骨細胞介導的骨形成相互協調的動態過程。骨骼系統與免疫系統密不可分，一方面，骨骼細胞與免疫細胞起源于相同的祖細胞，破骨細胞與免疫細胞都來源于造血干細胞。另一方面，骨骼系統與免疫系統共享相同的微環境，破骨細胞和成骨細胞的祖細胞都位于骨髓中，并且在骨髓中與免疫祖細胞或記憶細胞直接接觸-相互作用，調節骨骼的發生與發展[1]。此外，骨骼細胞與免疫細胞還共享多種細胞因子及相關受體。由此衍生出“骨免疫學”概念，以解釋骨骼系統與免疫系統間相互調控的機制。

骨骼系統與免疫系統間相互作用常涉及免疫系統活化后分泌細胞因子，引起骨代謝失衡[2]。在炎癥環境下，T細胞分泌炎性細胞因子，B細胞激活產生核因子κB 受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL)，促進破骨細胞的生成和骨吸收[3](圖1)。CD4+T細胞產生的細胞因子是骨偶聯的關鍵調節因子。CD4+T細胞分為Th1、Th2、Th17和Treg 4種類型。Th1細胞被認為在骨質丟失過程中起主要作用，分泌干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)和骨吸收細胞因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白介素-1(interleukin-1，IL-1)。Th2細胞分泌細胞因子白介素-4(interleukin-4，IL-4)參與炎性骨吸收。Th17細胞分泌的IFN-γ和白介素-17(interleukin-17，IL-17)，主要調控破骨前體細胞增殖、分化和凋亡。Treg細胞分泌白介素-10(interleukin-10，IL-10)，調節破骨細胞的生成和骨吸收[4]。這些研究都表明，細胞因子可以通過調節骨偶聯，進而影響骨代謝。因此，本文對CD4+T細胞分泌的細胞因子對骨偶聯的影響進行了總結。

圖1 免疫細胞分泌細胞因子調控骨偶聯

一、腫瘤壞死因子超家族

腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)是由單核細胞、巨噬細胞和T細胞分泌的細胞因子，已被證實在骨炎性疾病發展中起促進骨吸收的作用。TNF-α通過增加成骨細胞和基質細胞表達RANKL和巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，MCSF)間接誘導破骨細胞生成，也通過激活核轉錄因子(nuclear transcription factor kappa B，NF-κB)直接影響體內、外骨細胞RANKL的表達[5]。也有研究發現TNF-α和RANKL具有協同作用，它們都通過激活轉錄因子c-fos和活化T-細胞核因子1(activated T nuclear factor 1 protein，NFATc1)信號誘導破骨細胞分化。

TNF-α不僅能刺激破骨細胞的骨吸收，而且能抑制成骨細胞的形成。TNF-α通過抑制成骨細胞形成的經典通路，如Wnt通路，以及骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)通路，進而抑制成骨細胞形成。TNF-α通過激活NF-κB，干擾BMP通路中重要的信號元件Smad與其DNA結合，從而抑制BMP信號，進而抑制成骨細胞的生成[6]。而且，TNF-α刺激Wnt信號抑制劑DKK-1(dickkopf-1)和硬骨素(sclerostin，SOST)的產生，進而對Wnt通路進行負調控。此外，TNF-α還可以通過抑制成骨相關標志物如胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)、骨形成因子(osterix，Osx)和成骨相關轉錄因子2(runt-related transcription factor 2，Runx2)的表達來抑制骨形成。

二、轉化生長因子

轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族由轉化生長因子-βs、激活素、BMP等相關蛋白組成。TGF-β在骨骼中起多功能調節蛋白的作用，包括調控骨骼細胞的增殖和分化。TGF-β對破骨細胞有雙重調控作用，Karst等[7]使用骨髓來源的破骨細胞前體細胞和小鼠骨髓基質細胞(ST2)進行共培養，發現TGF-β在低濃度時增加破骨細胞的分化，而在高濃度時抑制破骨細胞的分化。TGF-β通過協同RANKL調節破骨細胞生成的關鍵調節因子NFATc1的基因表達促進破骨細胞生成。此外，TGF-β也可以通過參與Smad2/3介導的信號通路，上調RANKL的表達，誘導的破骨細胞生成。近年來研究發現，TGF-β在破骨細胞分化的早期(48h內)以劑量依賴性抑制破骨細胞生成。TGF對破骨細胞的抑制作用主要是通過降低破骨細胞特異性基因[如NFATc1、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)和組織蛋白酶K]的表達，以及抑制RANK誘導的NF-κB信號的激活[8]。

TGF-β對成骨細胞也存在雙重調控，不僅激活BMP通路中經典的Smad2/3介導的信號轉導，也激活Smad1/5介導的信號轉導，兩者皆是BMP通路中的重要信號元件。經典的Smad通路中，通過TGF-β-Smad信號轉導，減少RANKL/骨保護素(osteoprotegerin，OPG)受體激動劑的分泌，抑制破骨細胞分化，從而促進骨細胞的增殖和分化[7]。近年來有研究發現， TGF-β通過磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)依賴性方式誘導成骨細胞轉錄因子[Runx2、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、骨鈣素(osteocalcin、OCN)和Osx]的表達上調[9]。此外，TGF-β與甲狀旁腺激素、Wnt、BMP和成纖維細胞生長因子信號的協同作用，促進成骨細胞增殖和早期分化。盡管TGF-β在促進早期成骨細胞分化中起重要作用，然而，在成骨細胞的最終分化階段，TGF-β抑制Runx2的表達，阻止成骨細胞向終末階段分化，并將其維持在靜止狀態[10]。

三、干擾素

干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)是一種促炎性細胞因子，主要由T細胞、自然殺傷細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和B細胞分泌。干擾素在骨偶聯中對成骨細胞和破骨細胞的形成起著重要的調節作用。研究表明，干擾素-γ能誘導RANK接頭蛋白腫瘤壞死因子受體相關分子6(tumor necrosis factor receptor associated factor6，TRAF6)的快速降解，從而強烈抑制RANKL誘導的轉錄因子NF-κB和JNK的激活，進而抑制破骨細胞的形成。IFN-γ通過Fas/FasL信號誘導破骨細胞凋亡，對骨吸收進行間接調節。此外，干擾素-γ刺激成骨細胞產生一氧化氮(nitric oxide，NO)，進而促進破骨細胞凋亡。盡管，大部分研究表明IFN-γ抑制破骨細胞形成，促進破骨細胞凋亡。然而，也有研究表明IFN-γ可以通過刺激抗原依賴性T細胞活化和破骨細胞因子RANKL和TNF-α的分泌，間接刺激破骨細胞形成，促進骨吸收的作用[11]。

此外，研究發現，IFN-γ以劑量依賴的方式促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化，并上調Runx2、Osx、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和OCN的表達。在顱蓋成骨細胞的原代培養物中，外源性IFN-γ以劑量依賴性方式促進成骨細胞誘導的Ca2+沉積并誘導成骨基因的表達。該研究表明，IFN-γ通過促進增殖、分化和細胞外基質產生而促進成骨細胞生成[12]。

四、白介素家族

1.白介素-1：IL-1是一種促炎性細胞因子，由活化的單核-吞噬細胞系統生成，調節多種細胞和組織功能。IL-1有兩種形式，IL-1α和IL-1β，這兩種異構體都被證明可以激活破骨細胞。IL-1α和IL-1β都是通過與IL-1Ⅰ型受體(interleukin-1 type Ⅰ receptors，IL-1RⅠ)親和力結合來傳遞信號的。IL-1β被確認為破骨細胞激活因子，可以直接誘導破骨細胞前體細胞分化為成熟的破骨細胞，也可以通過上調RANKL的表達，增強其活性并促進破骨細胞生成及分化[13]。IL-1β可以增加M-CSF的產生來促進破骨細胞的活性，并抑制破骨細胞的凋亡[14]。此外，IL-1α可通過誘導骨髓巨噬細胞小轉錄因子(microphthalmia-associated transcription factor，MITF)不依賴RANKL直接誘導OC分化。IL-1β強烈抑制成骨細胞的形成，從而減少新骨的形成。這種對成骨細胞活性的抑制通過上調經典Wnt通路的拮抗劑DKK1和SOST的表達進行調節。IL-1β也可以激活非典型Wnt途徑，導致Wnt信號異常激活，軟骨和骨異常分化[15]。

2.白介素-4:由Th2細胞分泌的IL-4通過阻斷RANKL依賴的NF-κB、JNK、p38和ERK信號的激活，選擇性地抑制TNF信號轉導以阻止破骨細胞生成。在RANKL誘導的破骨細胞形成過程中，IL-4通過拮抗NF-κB的活化作用直接抑制RANKL誘導的NFATc1表達[16]。此外，IL-4通過減少促炎性細胞因子和破骨細胞因子(如TNF-α、IL-1和IL-6)的產生，間接參與破骨細胞形成。因此，IL-4具有抑制骨吸收的作用。近年來研究表明，IL-4對成骨細胞系MC3T3細胞的成骨能力無直接影響，但可以通過誘導ALP活性上調，間接促進成骨細胞形成[17]。

3.白介素-6：IL-6主要由髓樣細胞產生，是循環中最豐富的細胞因子。早期研究表明，IL-6通過誘導IL-1的釋放刺激骨髓培養物中破骨細胞樣多核細胞的形成。隨后，研究發現IL-6主要通過RANK/RANKL/OPG系統刺激破骨細胞分化和骨吸收。而且，IL-6可通過白介素家族細胞因子共受體和信號轉導子(IL-6R和gp130)增強1,25(OH)2D3誘導的骨髓間充質干細胞向破骨細胞分化。這表明，IL-6誘導破骨細胞前體細胞分化為成熟和活躍的破骨細胞。進一步研究發現，IL-6通過激活下游信號分子JAK2和RANKL增強了骨細胞介導的破骨細胞分化[18]。此外，IL-6被發現能促進成骨細胞分化，表現為成骨標志物ALP和OCN水平升高。近來研究發現，細胞培養物中的成骨細胞分泌可溶性IL-6受體(interleukin 6 soluble receptor，sIL-6R)，它們通過轉錄因子STAT3磷酸化和順式和反式信號轉導對IL-6作出反應，進而刺激體內骨形成[19]。然而，也有研究者發現，IL-6可以抑制成骨細胞分化而加劇了骨吸收。IL-6和sIL-6R均可通過減少參與成骨細胞分化的基因(包括ALP、Runx2和OCN)的表達而引起成骨細胞分化的降低[20]?；谏鲜鰞身椦芯拷Y果相反，因此IL-6對成骨細胞的分化有待于進一步研究。

4.白介素-10:IL-10是由活化的T淋巴細胞和B淋巴細胞產生的，具有抗炎和免疫抑制作用。IL-10是破骨細胞形成的直接抑制劑，研究證實，IL-10通過上調OPG的表達，下調RANKL和M-CSF的表達，進而抑制破骨細胞形成，并通過抑制NFATc1和組織蛋白酶K的表達，進而抑制破骨細胞分化[21]。IL-10通過下調破骨細胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-1的產生，抑制破骨細胞的生成。因此，IL-10被認為是抗破骨細胞因子。IL-10缺陷小鼠(IL-10-/-)小鼠通過下調ALP和OCN的表達影響成骨細胞的活性和分化。IL-10-/-小鼠表現為骨量減少，增加機械脆性并抑制骨形成，最終發展為骨質疏松癥。

5.白介素-17:IL-17是來源于CD4+T細胞、NK細胞和CD8+T細胞的炎性細胞因子。在骨偶聯中，IL-17誘導RANKL的表達，促進破骨細胞生成和骨吸收。研究發現，IL-17通過NF-κB途徑促進IL-6和IL-8的分泌，促進骨吸收。此外，IL-17還可以與IL-1和(或)TNF-α協同作用，加速骨吸收。IL-17缺陷小鼠(IL-17-/-)局部骨吸收明顯減少，證實IL-17可以促進體內破骨細胞的形成。IL-17在體外對破骨細胞前體的直接作用似乎取決于其濃度，低濃度的IL-17通過激活RANKL-JNK信號通路促進破骨細胞前體的自噬，從而增強RANKL誘導的破骨細胞分化。高濃度的IL-17激活細胞凋亡蛋白酶(caspase-3)抑制自噬的同時阻止了破骨細胞的生成[22,23]。研究發現，在大鼠/小鼠顱骨誘導成骨細胞過程中，IL-17通過上調Runx2、ALP、Osx、OCN和OPG成骨細胞分化基因的表達而促進成骨細胞的早期分化[24]。然而，也有研究表明，IL-17在體外通過增加Wnt/β-連環蛋白(β-catenin)途徑的拮抗劑來抑制成骨細胞的形成[25]。近年來研究發現，IL-17對ALP、OCN和Runx2的基因表達有抑制作用，可劑量依賴性地下調原代成骨細胞的ALP活性。IL-17通過BMP/Smad非依賴途徑抑制BMP-2誘導的成骨細胞分化[26]。這表明IL-17對成骨細胞的影響很難進行定義。IL-17對成骨細胞的作用有待于進一步研究。

6.白介素-23：IL-23是一種主要由活化的單核-吞噬細胞和樹突狀細胞釋放的促炎性細胞因子。IL-23可以通過增強T細胞、滑膜成纖維細胞和破骨細胞前體細胞RANKL的表達來刺激破骨細胞的生成。除了誘導RANKL途徑，IL-23通過激活自然殺傷激活受體相關蛋白DAP12及免疫受體酪氨酸激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)來協調破骨細胞的分化。與體外研究一致，IL-23的過表達導致小鼠關節炎和全身性骨丟失，而在缺乏IL-23的小鼠(IL-23-/-)中，炎性介導的骨破壞較不明顯，破骨細胞形成減少。盡管研究表明IL-23對成骨細胞的形成和表達沒有影響。然而，IL-23可以通過下游的細胞因子如IL-17或IL-22間接作用于成骨細胞。

表1 細胞因子對骨偶聯的影響

五、展 望

骨免疫學概念的提出已經有將近20年的歷史了，研究人員致力于為骨骼系統和免疫系統相互作用的方式提供新的見解。骨骼系統與免疫系統之間的調控機制非常復雜，緊密相連，并且涉及許多參與者。免疫細胞分泌細胞因子分別調控成骨細胞和破骨細胞，進而影響骨偶聯(表1)。許多缺乏特定細胞因子的小鼠模型顯示出明顯的骨重塑狀態受損。細胞因子IL-1、IL-6和TNF-α是骨吸收的重要調節因子，在骨丟失中起重要作用?，F在正在開發各種策略通過干擾細胞因子的分泌，抑制破骨細胞形成，從而減少骨質流失。然而，細胞因子通過對骨偶聯調節導致骨代謝疾病的發病機制尚不清楚。闡明這種潛在的關系不僅可以為臨床醫生提供一個額外的工具來識別有骨代謝疾病風險的患者，還可以為細胞因子阻斷療法的發展提供信息。已有研究表明細胞因子的增加與骨量減少和骨折風險有關，但總體證據是有限的。因此，還需要開展深入的研究來確定細胞因子在骨偶聯中的具體作用。