應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討速效平喘合劑治療支氣管哮喘合并氣道重塑的作用機(jī)制

胡金濤，曹俊嶺，歐陽競鋒，王添全，胡志偉，林美嬌

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100700； 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100078； 3.中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，北京 100010； 4.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院臨床藥理系，北京 102488； 5.大連市中醫(yī)醫(yī)院骨科，遼寧 大連 116000)

支氣管哮喘是以慢性氣道炎癥和可逆性氣道重塑為特征的異質(zhì)性呼吸道疾病[1]，主要表現(xiàn)為喘息、胸悶和咳嗽等一系列呼吸系統(tǒng)癥狀，這些癥狀隨著發(fā)病時間和強(qiáng)度的改變而變化，具有呼氣氣流受限和氣道對一系列刺激物(如運(yùn)動和吸入刺激物)的高反應(yīng)性等特征[2-3]。目前，西醫(yī)方面以吸入性皮質(zhì)類固醇、長效β2腎上腺素能受體激動劑、長效毒蕈堿拮抗劑、白三烯受體拮抗劑以及針對最嚴(yán)重疾病的IgE特異性單克隆抗體Omalizumab為主要治療手段，盡管這種逐層分類的治療方法可以改善患者哮喘癥狀，減少對吸入短效支氣管擴(kuò)張劑的依賴性，但這些治療方法均無法改變疾病的自然史[3]。

速效平喘合劑是由海派中醫(yī)兒科徐氏家族第四代傳人趙坤教授創(chuàng)制的治療小兒哮病急性發(fā)作的經(jīng)驗(yàn)方，該方由小青龍湯、三子養(yǎng)親湯等經(jīng)典名方化裁改良而成，具有瀉肺定喘、降氣化痰之功效。臨床試驗(yàn)表明，速效平喘合劑對難治型(氣道重塑型)哮喘具有較好的療效[4]，但其治療哮喘及氣道重塑的有效成分與作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討速效平喘合劑治療支氣管哮喘、改善氣道重塑的關(guān)鍵靶點(diǎn)以及可能通路，再用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證速效平喘合劑的藥效和潛在作用機(jī)制，以期為臨床使用速效平喘合劑中藥制劑治療支氣管哮喘提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1速效平喘合劑有效成分與潛在靶點(diǎn)篩選 搜索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(https://www.tcmspw.com/tcmsp.php)獲取速效平喘合劑中麻黃、白芍、細(xì)辛、桑白皮、葶藶子、芥子、紫蘇子、萊菔子、款冬花9味中藥全部化學(xué)成分和靶點(diǎn)，搜索其他文獻(xiàn)以完善9味中藥成分[5-11]，其中主要有效成分的篩選條件為口服生物利用度≥30%及已知藥物的相似性≥0.18。將9味中藥的靶點(diǎn)輸入Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://uniprot.org/)使靶點(diǎn)名稱標(biāo)準(zhǔn)化。查閱已有文獻(xiàn)獲得地龍有效成分，在SwissADME平臺(http://www.swissadme.ch/)進(jìn)行活性成分篩選后，查閱PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)或使用Chemdraw 1.6軟件繪圖獲取地龍活性成分的分子結(jié)構(gòu)式，再通過搜索Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)獲得地龍的潛在靶點(diǎn)。

1.2速效平喘合劑靶點(diǎn)-網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選的成分重新編碼后，匯總10種中藥的成分與靶點(diǎn)，使用Cytoscape 3.8軟件繪制藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征分析，以自由度值作為重要有效成分的依據(jù)。

1.3支氣管哮喘-氣道重塑靶點(diǎn)的收集及藥物疾病共同靶點(diǎn)的篩選 以“bronchial asthma”“asthma”和“airway remodeling”為關(guān)鍵詞，搜索Genecards(https://www.genecards.org/)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)(https://www.omim.org/)、Drugbank(https://go.drugbank.com/)等在線數(shù)據(jù)庫，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，匯總?cè)ブ厝〗患@取與支氣管哮喘及氣道重塑相關(guān)的靶點(diǎn)，利用韋恩圖繪制平臺Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)獲取速效平喘合劑、支氣管哮喘與氣道重塑的藥物-疾病的交集靶點(diǎn)。

1.4蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將速效平喘合劑、支氣管哮喘與氣道重塑的藥物-疾病的交集靶點(diǎn)錄入String數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/cgi/input.pl)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，選擇分類為人類，置信度≥0.4，導(dǎo)出的tsv文件可使用Cytoscape 3.8軟件分析與繪圖。篩選核心靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)為自由度、中介中心度、接近中心度及鄰里連通性均大于中位數(shù)。

1.5基因本體(gene ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路分析 應(yīng)用Metascape數(shù)據(jù)平臺(https://metascape.org/)對核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO、KEGG富集分析，設(shè)定P≤0.05，分析速效平喘合劑治療支氣管哮喘-氣道重塑潛在的生物過程、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、分子功能以及信號通路，構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)并使用Cytoscape 3.8軟件繪制其網(wǎng)絡(luò)。利用微生信在線平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)繪制GO分析條狀圖以及KEGG富集氣泡圖。

1.6動物實(shí)驗(yàn)

1.6.1實(shí)驗(yàn)用藥 速效平喘合劑的主要成分為麻黃30 g、白芍100 g、細(xì)辛40 g、桑白皮100 g、葶藶子100 g、白芥子65 g、紫蘇子100 g、萊菔子150 g、地龍130 g、款冬花120 g。中藥藥片購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院。制備方法參考《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[12]及《中藥煎煮法的現(xiàn)代研究概況》[13]中的煎煮提取法制備。醋酸地塞米松片(0.75 mg/片)購自上海信誼有限公司(批號：110302)，使用時按0.075 mg/mL濃度配制成溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。小鼠給藥劑量參考《實(shí)驗(yàn)動物與動物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[14]中的公式計算，小鼠低、中、高給藥劑量分別相當(dāng)于60 kg成人臨床劑量的5倍、10倍和20倍。將速效平喘合劑溶于0.9%氯化鈉溶液中，用0.22 μm膜過濾后再使用。

1.6.2試劑和儀器 卵白蛋白(美國Sigma公司，批號：A5503)，Al(OH)3(美國Sigma公司，批號：239186),轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)兔多克隆抗體(美國Proteintech公司，批號：21898-1-AP)，過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)多克隆抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：AF797)。相差顯微鏡(日本奧林巴斯，型號BX51)，顯微圖像分析系統(tǒng)(日本奧林巴斯，型號VS120-S6)。

1.6.3實(shí)驗(yàn)方法 60只無特定病原體級BALB/c小鼠，雌雄各半，4～6周齡，體重18～22 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供[生產(chǎn)許可證：SCXK(京)2012-0001]。實(shí)驗(yàn)動物統(tǒng)一在中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動物房的獨(dú)立送風(fēng)籠中飼養(yǎng)，溫度20～24 ℃，濕度50%～70%，雌雄分開飼養(yǎng)，自由飲水、進(jìn)食，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。動物實(shí)驗(yàn)的開展經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。采用隨機(jī)數(shù)字法將60只BALB/c小鼠分為空白組、模型組、陽性組以及速效平喘合劑低、中、高劑量組，每組10只，雌雄各半。

除空白組外，其余小鼠在第1天和第15天接受腹腔注射AL(OL)3/卵白蛋白溶液(1 mL/20 g)和5%卵白蛋白溶液霧化吸入，在第23～29天霧化吸入5%卵白蛋白溶液建模，在造模前與最后一次造模后的15 min內(nèi)，對各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行打噴嚏、擦鼻動作、呼吸等活動狀態(tài)進(jìn)行觀察評估以判斷造模結(jié)果。

在第23～29天進(jìn)行給藥，其中陽性組給予0.1 mg/mL的地塞米松溶液，速效平喘合劑低、中、高劑量組分別予以1、2、4 g濃度梯度速效平喘合劑，空白組和模型組予以等量0.9%氯化鈉溶液。在實(shí)驗(yàn)第30天進(jìn)行肺組織取材、4%的甲醛溶液固定、石蠟包埋、石蠟切片，切片后嚴(yán)格按照免疫組織化學(xué)染色法進(jìn)行PPARγ、TGF-β1染色，若出現(xiàn)棕黃色則為PPARγ及TGF-β1表達(dá)陽性。

2 結(jié) 果

2.1活性成分及有效靶點(diǎn)的篩選 根據(jù)設(shè)定的條件篩選中藥有效成分共119個，靶點(diǎn)816個，每味中藥的成分?jǐn)?shù)量如下：地龍36個，款冬花22個，生白芍13個，葶藶子12個，炙麻黃23個，細(xì)辛8個，桑白皮31個，芥子1個，萊菔子1個，紫蘇子16個，共有成分11個，以拼音首字母重新編碼，共有成分編號為GY1～11。采用Cytoscape 3.8繪制速效平喘合劑“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，包含973個節(jié)點(diǎn)，2 856條邊，見圖1。主要成分自由度值見表1。

表1 速效平喘合劑主要有效成分基本信息

續(xù)表1

2.2藥物疾病共有靶點(diǎn)的獲取 以“bronchial asthma”和“asthma”為關(guān)鍵詞檢索，在Drugbank數(shù)據(jù)庫獲取1個靶點(diǎn)、Genecards數(shù)據(jù)庫獲取861個靶點(diǎn)、OMIM數(shù)據(jù)庫獲取12個靶點(diǎn)，合并去重共計874個。以“airway remodeling”為關(guān)鍵詞檢索，在Drugbank數(shù)據(jù)庫獲取靶點(diǎn)663個、Genecards數(shù)據(jù)庫獲取1 323個、OMIM數(shù)據(jù)庫獲取44個，合并去重共計1 645個。將874個支氣管哮喘靶點(diǎn)、1 645個氣道重塑靶點(diǎn)與816個速效平喘合劑靶點(diǎn)共同繪制韋恩圖取交集，結(jié)果得到支氣管哮喘-氣道重塑交集靶點(diǎn)590個，速效平喘合劑與支氣管哮喘-氣道重塑交集靶點(diǎn)203個，見圖2。

2.3共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 以自由度≥38、中介中心度≥0.001 485 192、接近中心度≥0.547 425 474、鄰里連通性≥74.482 142 86為條件，篩選得出32個核心靶點(diǎn)，PPI網(wǎng)絡(luò)圖見圖3。

2.4GO富集分析和KEGG通路分析 GO富集分析結(jié)果顯示，共得到主要條目中涉及生物過程913條，細(xì)胞組成15條，分子功能48條。速效平喘合劑-哮喘-氣道重塑交集基因的生物學(xué)過程包括細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路、細(xì)胞遷移的正調(diào)控、骨髓細(xì)胞分化等；主要涉及的細(xì)胞結(jié)構(gòu)包括膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等；主要的分子功能集中于蛋白激酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。見圖4。

KEGG通路富集分析共獲得78條信號通路(P<0.05)，根據(jù)Log(Q)值并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)篩選得到相關(guān)性較強(qiáng)的前20條通路(圖5)，每條通路所涉及的基因見表2，其中前3種通路分別為白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-17、缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路。

表2 KEGG富集分析結(jié)果

2.5“藥物-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 藥物-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖見圖6，包含92個節(jié)點(diǎn)，264條邊，網(wǎng)絡(luò)分析見表3。

表3 藥物-活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)分析

續(xù)表3

2.6免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 與空白組相比，模型組PPARγ和TGF-β1的陽性表達(dá)明顯；與模型組相比，陽性組及速效平喘合劑低、中、高劑量組PPARγ和TGF-β1的表達(dá)呈劑量依賴性降低，與之前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的PPARγ、TGF-β1是速效平喘合劑調(diào)控支氣管哮喘合并氣道重塑的關(guān)鍵靶點(diǎn)這一結(jié)果相符。見圖7、8。

GO：基因本體；BP：生物學(xué)過程；CC：細(xì)胞結(jié)構(gòu)；MF：分子功能

綠色圓圈表示藥物，藍(lán)色正方形表示藥物成分，黃色正方形表示藥物共有成分，淺藍(lán)色正八邊形表示通路，紅色圓形表示治療關(guān)鍵靶點(diǎn)

PPARγ：過氧化物酶體增殖物激活受體γ

TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長因子-β1

3 討 論

哮喘屬中醫(yī)學(xué)中的“哮證”范疇，其基本病機(jī)在于“風(fēng)盛正虛、氣逆痰阻”，“風(fēng)盛”相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中引起哮喘急性發(fā)作的變應(yīng)原或呼吸道感染，常作為外因；“痰阻”指出了哮喘之宿根為痰，若阻塞氣道可作為哮喘發(fā)病的內(nèi)因。哮喘之痰常以無形之痰為主，故哮喘者每發(fā)咳喘痰量不多、難以咯出；頑痰伏于肺絡(luò)，致氣道攣急，故咳嗽喘息頻繁。針對“風(fēng)盛正虛、氣逆痰阻”之病機(jī)，速效平喘合劑以瀉肺定喘、降氣豁痰為法，由小青龍湯及三子養(yǎng)親湯等經(jīng)典名方加減化裁而成。方中炙麻黃、白芍一散一收，宣肺斂氣平喘；葶藶子治痰壅喘咳，與芥子、紫蘇子合而為用，降氣消痰；細(xì)辛溫陽化飲，款冬花潤肺化痰止咳，增強(qiáng)化痰之效；地龍咸寒，寧肝熄風(fēng)，解痙平喘。全方降氣平喘，清熱化痰，降氣平喘，共奏理肺平喘之功。

本研究首先用TCMSP數(shù)據(jù)庫及SwissADME平臺篩選出速效平喘合劑中的主要有效化合物119個，主要包括槲皮素、木犀草素、二氫辣椒素、β-谷甾醇、花生四烯酰胺、18-羥基二十碳五烯酸、14,8,5-二十碳酰胺、山柰酚、β-胡蘿卜素及柚皮素等。上述化學(xué)成分具有抑制哮喘氣道慢性炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)氣道高反應(yīng)、改善氣道重構(gòu)的作用，尤其在抑制氣道炎性方面作用明顯。如木犀草素能調(diào)節(jié)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶/一氧化氮信號通路，從而減輕哮喘幼鼠氣道炎癥，同時還能抑制促分裂原活化的蛋白激酶激酶/胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2信號通路，從而抑制氣道重塑[15-16]；槲皮素通過抑制哮喘大鼠IL-5、IL-6、嗜酸粒細(xì)胞、IgE等炎癥細(xì)胞和炎癥因子水平，提高機(jī)體γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)的表達(dá)[17-18]。

本研究根據(jù)基因交集PPI網(wǎng)絡(luò)得到速效平喘合劑治療哮喘及氣道重塑的核心靶點(diǎn)共32個，主要包括促分裂原活化的蛋白激酶14(mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14)、IFN-γ、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1,HMOX1)及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1(signal transduction and activator of transcription 1，STAT1)等。其中，IFN-γ參與哮喘發(fā)生發(fā)展過程被廣泛研究，其能特異性負(fù)反饋調(diào)節(jié)氣道的過敏性免疫反應(yīng)[19]。此外，有研究表明哮喘大鼠氣道慢性炎癥、氣道高反應(yīng)性及氣道重塑三大特點(diǎn)均與mTOR異常表達(dá)有關(guān)[20]。同時，有研究表明哮喘患兒外周血STAT1 mRNA表達(dá)升高可增加嗜酸粒細(xì)胞百分比，加重哮喘發(fā)作的炎癥反應(yīng)[21]。

本研究通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)速效平喘合劑基因靶點(diǎn)集中在細(xì)胞遷移、細(xì)胞對激素及生長因子刺激等反應(yīng)，以及與DNA或蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞因子及泛素樣蛋白連接酶結(jié)合等相關(guān)的生物學(xué)過程上。而通過KEGG通路富集分析得知與哮喘及氣道重塑密切的靶點(diǎn)主要富集在IL-17、HIF-1及PI3K/Akt信號通路上，表明速效平喘合劑可能通過相關(guān)靶基因來調(diào)節(jié)所對應(yīng)信號通路，從而調(diào)控免疫，抑制氣道重構(gòu)，發(fā)揮治療哮喘的作用。研究表明，IL-17信號通路下游蛋白Th17能通過加強(qiáng)氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性引起或加重哮喘[22-24]。PI3K/Akt信號通路通常與細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、分化、凋亡等過程密切相關(guān)[25]。有研究報道，PI3K/Akt信號通路的激活促進(jìn)哮喘氣道重塑，也是成人哮喘發(fā)作期炎癥反應(yīng)強(qiáng)弱的決定因素[26-28]。HIF-1是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，機(jī)體的缺血缺氧環(huán)境誘導(dǎo)其產(chǎn)生[29]。研究表明，哮喘發(fā)作時的缺氧環(huán)境導(dǎo)致HIF-1在哮喘肺組織中的表達(dá)增強(qiáng)[30]。此外，HIF-1通過免疫調(diào)節(jié)、能量代謝、炎癥反應(yīng)、血管生成等途徑誘使和促進(jìn)哮喘患者氣道重塑的產(chǎn)生[31]。

本研究通過建立哮喘大鼠模型，用免疫組織化學(xué)法驗(yàn)證速效平喘合劑治療支氣管哮喘大鼠療效及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測機(jī)制的準(zhǔn)確性。PPARγ是本研究所得出的關(guān)鍵靶點(diǎn)，其是配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，主要參與機(jī)體慢性炎癥和免疫反應(yīng)[32]。TGF-β1是一種前纖維化生長因子，能夠影響成纖維細(xì)胞和相關(guān)蛋白的合成，引發(fā)并維持哮喘氣道重塑[33]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果一致，即PPARγ及TGF-β1為速效平喘合劑治療支氣管哮喘和氣道重塑的潛在靶點(diǎn)。

綜上所述，速效平喘合劑可能通過槲皮素及木犀草素等有效成分作用于MAPK14、HMOX1、IFN-γ、mTOR及STAT1等靶點(diǎn)，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、細(xì)胞對激素及生長因子刺激等反應(yīng)，以及與DNA或蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞因子及泛素樣蛋白連接酶結(jié)合等相關(guān)的生物學(xué)過程，干預(yù)HIF-1及PI3K/Akt等信號通路，抑制哮喘氣道慢性炎癥和氣道重塑。