ApoA-Ⅰ及其模擬肽在動脈粥樣硬化中的作用研究進展

林俍良，張志珍

(廣東醫科大學生物化學與分子生物學教研室，廣東 東莞 523808)

心血管疾病已成為導致人類死亡的首位疾病，高血壓、高血糖和高膽固醇血癥等被認為是驅動心血管疾病的關鍵因素，其中血脂異常是最相關的危險因素之一。動脈粥樣硬化是心血管疾病的病理基礎，也是引發心血管疾病發生和患者死亡的主要原因[1]。因此，減少動脈壁細胞(包括巨噬細胞)內膽固醇的積聚是心血管疾病治療的靶標之一，可阻止動脈粥樣硬化進展，降低心血管疾病和腦卒中的發生風險。

載脂蛋白(apolipoprotein，Apo)A-Ⅰ是高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)的主要蛋白成分，在新生HDL的生物合成過程中起重要作用，可促使富含脂質的巨噬細胞中多余膽固醇的流出，在調節膽固醇運輸、預防或逆轉動脈粥樣硬化性心血管疾病方面起關鍵作用。最近的研究表明，ApoA-Ⅰ含量及質量的改變除能夠影響機體膽固醇代謝外，還參與了斑塊從早期到晚期的進展過程，該過程涉及其他許多因素，如氧化應激和炎癥[2]，但ApoA-Ⅰ調節動脈粥樣硬化斑塊發生發展的潛在機制尚不清楚。隨著對ApoA-Ⅰ的結構與功能以及ApoA-Ⅰ與心血管疾病相關蛋白相互作用研究的深入，一些ApoA-Ⅰ模擬肽已經被測試，并期望開發出能夠促進膽固醇外流、維持機體脂質代謝平衡的靶向藥物，為預防和改善動脈粥樣硬化性心血管疾病提供幫助。現就ApoA-Ⅰ參與膽固醇逆向轉運、介導泡沫細胞膽固醇外流、靶向ApoA-Ⅰ序列設計的模擬肽在動脈粥樣硬化中的研究進展予以綜述。

1 ApoA-Ⅰ的結構與作用

1.1ApoA-Ⅰ的結構 成熟ApoA-Ⅰ由243個氨基酸殘基組成，利用X射線晶體衍射并結合突變分析和功能研究發現[3]，貧脂ApoA-Ⅰ(lipid-free ApoA-Ⅰ)的結構可分為N端(1～43位氨基酸區段)、中心區域(44～184位氨基酸區段)、C端(185～243位氨基酸區段)。N端在9～13位氨基酸區段形成一個短的雙親性α螺旋，對維持ApoA-Ⅰ結構穩定有重要作用。ApoA-Ⅰ的中心區域包含無序結構和雙親性的α螺旋，其中131～143位氨基酸區段不能折疊為明確的空間結構(即無序結構或無序區域)，這一區域可能具有鉸鏈結構域的功能，連接N端和 C端；143～164位氨基酸區段形成卵磷脂膽固醇酰基轉移酶活化結構域；165～175位氨基酸區段對ApoA-Ⅰ正確折疊至關重要。ApoA-Ⅰ的C端在啟動脂質結合過程中有重要作用，并參與細胞內膽固醇外流。C端第220～231位氨基酸區段形成的α螺旋是腺苷三磷酸結合盒轉運體(ATP binding cassette transporter，ABC)A1的結合域[4]，此段螺旋高度保守，是ApoA-Ⅰ發揮功能不可或缺的序列。

ApoA-Ⅰ的二級結構主要由α螺旋、β折疊和無規則卷曲(有序非重復結構)構成，ApoA-Ⅰ的螺旋結構分為A、H、L、G、K、C、M、Y類，其基本結構是A類呈雙親性的α螺旋[3]，該α螺旋一側具有疏水性，另一側具有親水性；雙親性表面的連接點為賴氨酸、精氨酸、組氨酸等帶正電荷的氨基酸殘基；親水性表面含有天冬氨酸、谷氨酸等帶負電荷的氨基酸殘基。ApoA-Ⅰ的三級結構由N端形成的反向平行螺旋束以及C端的α螺旋所形成的結構域組成[5]。

1.2ApoA-Ⅰ在HDL形成中的作用 血漿HDL主要包括顆粒較大、密度較低的HDL2和顆粒較小、密度較高的HDL3[6]，由脂質(如磷脂、膽固醇酯、三酰甘油、游離膽固醇、鞘脂)、Apo、脂質轉移蛋白等組成，其中的蛋白以ApoA-Ⅰ和ApoA-Ⅱ為主。ApoA-Ⅰ對HDL結構的穩定性和功能的完整性至關重要。在HDL的形成過程中，貧脂ApoA-Ⅰ可由肝臟和小腸黏膜細胞合成并分泌，在初始狀態下，單體ApoA-Ⅰ的C端結構域靠近細胞膜脂質表面，隨后進入中間狀態，單體ApoA-Ⅰ通過C端的雙親性α螺旋與脂質雙分子層錨定，再與ABCA1相互作用，并與磷脂、膽固醇結合；在最終狀態，兩個單體ApoA-Ⅰ包繞磷脂雙分子層，形成圓盤狀雙脂層的新生HDL顆粒，隨后新生HDL從細胞膜釋放出來[5]，見圖1。新生HDL顆粒不斷將細胞內的膽固醇酯裝載至疏水核中，逐步膨脹為顆粒較小、密度較高的脂單層球狀顆粒(即成熟HDL3)。HDL3繼續在卵磷脂膽固醇酰基轉移酶的作用下，催化卵磷脂2位脂肪酸(通常是亞油酸)轉移到游離膽固醇，使之生成膽固醇酯，逐步轉變為顆粒較大、密度較低的HDL2，具有更強的膽固醇攜帶能力[7]。

圖1 ApoA-Ⅰ參與HDL形成的示意圖

ABCA1和ABCG1介導的膽固醇外流是ApoA-Ⅰ攝取膽固醇、磷脂以及HDL顆粒形成過程中的必需過程，HDL顆粒的脂質組成和功能與ApoA-Ⅰ的脂質結合能力之間存在密切聯系，主要取決于ApoA-Ⅰ的數量和ApoA-Ⅰ與膽固醇的有效結合位點[8]。有研究指出，ApoA-Ⅰ與ABCA1結合可增加胞外信號調節激酶、p38促分裂原活化的蛋白激酶、蛋白激酶(protein kinase，PK)B和PKC信號通路中膜聯蛋白A1的表達，使脂質從質膜的內側面移到外側面，調節細胞膽固醇外流[9]。有研究認為，ApoA-Ⅰ和ABCA1之間沒有直接的相互作用，脂質僅通過被動擴散加載到ApoA-Ⅰ上[10]。因此，新生HDL顆粒形成過程中ApoA-Ⅰ與ABCA1之間的相互作用還需進一步深入研究。

2 ApoA-Ⅰ與動脈粥樣硬化

2.1ApoA-Ⅰ的抗動脈粥樣硬化作用 動脈粥樣硬化是一種多因素、多環節的慢性血管疾病，其血管病理主要是內皮功能障礙、膽固醇和低密度脂蛋白在血管壁沉積、血管平滑肌細胞增殖、纖維蛋白沉積增加了內膜和中膜的厚度及血管壁鈣化，逐步發展為動脈粥樣硬化斑塊，隨后斑塊擴張和破裂，形成血栓[11]。巨噬細胞是早期和晚期動脈粥樣硬化的核心細胞成分，通過吞噬氧化或其他化學修飾的低密度脂蛋白形成泡沫細胞，進而遷移到內膜和中膜，逐漸形成動脈粥樣硬化斑塊[12]，因此對動脈粥樣硬化的早期治療極為重要。對敲除ApoB和ApoA-Ⅰ/低密度脂蛋白受體雙基因的高脂血癥模型小鼠的研究證實，ApoA-Ⅰ缺失導致模型小鼠動脈粥樣硬化斑塊增加[13]。此外，ApoA-Ⅰ過表達能減輕ApoE敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊的炎癥狀態，影響斑塊的穩定性[14]。這些研究結果為ApoA-Ⅰ抗動脈粥樣硬化作用的研究提供了有力證據。

HDL的主要功能是參與膽固醇逆向轉運(reverse cholesterol transport，RCT)，將肝外組織細胞中的膽固醇通過血液循環轉運至肝臟，并轉化為膽汁酸后排出體外。膽固醇從肝外組織細胞(包括巨噬泡沫細胞)中移出是RCT的第一步，而ApoA-Ⅰ是驅動RCT的關鍵蛋白，其作為HDL的主要蛋白質，能夠維持HDL顆粒結構的穩定，并刺激膽固醇從細胞向HDL流出，使HDL顆粒增大[15]。在RCT過程中，ApoA-Ⅰ在HDL與B族Ⅰ型清道夫受體或ABCA1/ABCG1的相互作用中發揮重要作用[16]，主要通過核受體如視黃酸X受體、過氧化物酶體增殖物激活受體和肝X受體調控ABCA1和ABCG1基因的轉錄和蛋白表達。

在動脈粥樣硬化斑塊中，ApoA-Ⅰ能夠作為游離膽固醇和磷脂的受體，通過與ABCA1的相互作用介導泡沫細胞內過量膽固醇外流，有助于消除多余的膽固醇并影響斑塊的穩定性。研究表明，在ApoA-Ⅰ的介導下，細胞內腺苷酸環化酶1催化ATP產生環腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)，激活下游信號轉導，在ABCA1和囊泡蛋白β-COP等參與下，膽固醇以囊泡形式被胞吐至細胞表面形成突起復合物，進一步與ApoA-Ⅰ相互作用，形成新生HDL顆粒釋放到介質中[17-18]。ApoA-Ⅰ通過影響腺苷酸環化酶活性升高細胞內cAMP水平，進而cAMP通過激活PKA影響ABCA1的功能。cAMP/PKA通路在ABCA1磷酸化和調節細胞內膽固醇外流過程中起重要作用，ABCA1的核苷酸結合域有絲氨酸1042位點(Ser1042)和絲氨酸2054位點(Ser2054)兩個主要的磷酸化位點[19]，活化的PKA使ABCA1磷酸化水平增加，與ApoA-Ⅰ相互作用能力增強。

臨床研究證實，ApoA-Ⅰ還可通過增加功能性HDL顆粒，在很大程度上促進動脈粥樣硬化的消退；在糖尿病小鼠中表達的人類ApoA-Ⅰ基因能改善HDL功能，減少和防止單核細胞聚集，有效減緩動脈粥樣硬化斑塊發展[20]。Paul等[21]對人類動脈粥樣硬化斑塊的脂質組學研究發現，包括氧化甾醇在內的多種脂類在動脈粥樣硬化發生過程中積累，而ApoA-Ⅰ可顯著降低動脈粥樣硬化斑塊中各種氧化甾醇、鞘磷脂和神經酰胺的富集，提示ApoA-Ⅰ具有重編程泡沫細胞內脂質體的能力，進而改善動脈粥樣硬化病變情況。ApoA-Ⅰ主要通過促進膽固醇外流和RCT發揮抗動脈粥樣硬化的功能，并具有抗炎和抗氧化作用。

2.2ApoA-Ⅰ的抗炎作用 炎癥反應貫穿動脈粥樣硬化發展的各個時期，炎癥細胞的浸潤和炎癥介質的釋放、氧化應激、內皮細胞增殖在動脈粥樣硬化中均起到重要作用，如內皮細胞功能紊亂、動脈內膜脂肪條紋形成和斑塊破裂[22]。促炎因子可直接損傷內皮細胞，引發炎癥反應，促進了早期動脈粥樣硬化斑塊的形成。巨噬細胞中膽固醇的過量累積不僅導致泡沫細胞形成，還會導致炎癥，而ApoA-Ⅰ可以減緩炎癥進程。ApoA-Ⅰ基因的啟動子包含一些核受體的結合序列，如肝細胞核因子4α、過氧化物酶體增殖物激活受體α/γ、肝臟受體同系物-1、視黃酸X受體α、肝X受體α/β、法尼酯X受體、ApoA-Ⅰ調控蛋白1、叉頭框蛋白A2和叉頭框蛋白O1等。ABCA1通過去除活性氧類抑制白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α分泌和核因子κB信號通路，進而降低炎癥反應，該過程與ApoA-Ⅰ的功能有關。腫瘤壞死因子-α也可調節單核細胞和巨噬細胞中與ApoA-Ⅰ基因啟動子結合的過氧化物酶體增殖物激活受體α、肝X受體α和肝X受體β的水平[23]。

在ABCA1和ABCG1介導的巨噬細胞膽固醇外流過程中，ApoA-Ⅰ和HDL還能減弱Toll樣受體信號，在細胞中發揮抗炎作用[24]。許多Toll樣受體信號轉導通路高度依賴于脂筏中的膽固醇，脂筏是細胞膜上富含鞘糖脂、膽固醇和蛋白質受體的特定區域，ApoA-Ⅰ和HDL可通過調節脂筏影響炎癥信號轉導過程。Witkowski等[25]報道，ApoA-Ⅰ可能通過調節巨噬細胞中Toll樣受體4依賴的信號轉導通路發揮抗炎作用。另外，ApoA-Ⅰ與ABCA1相互作用可抑制氧化型低密度脂蛋白攝取、泡沫細胞形成及其相關炎癥細胞因子分泌，進而降低血管壁炎癥和血管壁平滑肌細胞功能障礙[26]，提示高水平ApoA-Ⅰ能減輕血管炎癥、抑制泡沫細胞形成，增加易損斑塊的穩定性。由此可見，巨噬細胞或內皮細胞中膽固醇的積累可作為一種危險信號激活炎癥小體并導致慢性炎癥，而ApoA-Ⅰ可抑制這種炎癥。

2.3ApoA-Ⅰ的抗氧化作用 巨噬細胞(特別是M2型巨噬細胞)、中性粒細胞和單核細胞均可影響ApoA-Ⅰ的功能，并釋放髓過氧化物酶。ApoA-Ⅰ是動脈粥樣硬化斑塊內髓過氧化物酶氧化修飾的靶點，髓過氧化物酶能氧化ApoA-Ⅰ中的蛋氨酸、色氨酸和酪氨酸殘基，進而影響ApoA-Ⅰ的功能[27]。ApoA-Ⅰ中蛋氨酸的氧化改變了ApoA-Ⅰ的三級結構，產生了可溶的氧化單體，其釋放細胞膽固醇以及與巨噬細胞結合的能力更強，且更易聚集成淀粉樣蛋白，并在動脈粥樣硬化斑塊內形成淀粉樣物質[28]。在動脈粥樣硬化病變中，ApoA-Ⅰ的第72位色氨酸通過5-羥色氨酸發生氧化修飾，導致膽固醇外流減少[29]，色氨酸殘基的氧化發揮了對內皮細胞的促炎特性。對氧磷酶是一種糖蛋白，也是HDL的組成成分。研究表明，在炎癥過程中，髓過氧化物酶和對氧磷酶1可影響HDL功能，可促進對氧磷酶1和ApoA-Ⅰ的氧化修飾，氧化的ApoA-Ⅰ導致HDL功能失調，最終影響膽固醇的流出[30]。綜上，在巨噬細胞和內皮細胞在動脈粥樣硬化進程中，ApoA-Ⅰ均參與調節了膽固醇運輸以及抗氧化，提示ApoA-Ⅰ可作為調節膽固醇積累、影響動脈粥樣硬化形成的潛在藥物靶點。

3 ApoA-Ⅰ模擬肽與動脈粥樣硬化

3.1ApoA-Ⅰ模擬肽的發現 動脈粥樣硬化的特點為脂質累積以及中、大動脈的慢性炎癥，臨床并發癥主要發生于動脈粥樣硬化晚期，表現為血管高度脆弱、易破裂、斑塊內出血以及血栓形成[31]。目前對動脈粥樣硬化的治療主要集中在降低血脂上，因此需要新的治療策略和藥物。ApoA-Ⅰ生產成本高、口服生物利用率低等限制了其應用，因此靶向模擬或過表達ApoA-Ⅰ作為動脈粥樣硬化治療策略有重大意義。ApoA-Ⅰ模擬肽是通過模擬ApoA-Ⅰ結構開發的合成肽，具有與ApoA-Ⅰ相似的促進膽固醇外流、抗炎、抗氧化功能，具有類似于天然ApoA-Ⅰ的生物學特征[32]。ApoA-Ⅰ的二級結構含有與脂質相互作用所必需的10個雙親性α螺旋，該結構已被用作設計ApoA-Ⅰ模擬肽的模板。利用ApoA-Ⅰ模擬肽增加ApoA-Ⅰ表達水平有望刺激膽固醇的轉運。實驗表明，ApoA-Ⅰ模擬肽具有與天然ApoA-Ⅰ相同的促進膽固醇外流的特性，小鼠模型的血脂水平降低、膽固醇外流增加、動脈壁異常增厚抑制[33]。

基于ApoA-Ⅰ二級結構A類螺旋設計合成出第一個ApoA-Ⅰ模擬肽——含18個氨基酸的短肽(18A)，該短肽經過多次修飾后形成了較ApoA-Ⅰ同源性、脂質親和力、抗動脈粥樣硬化能力均增強的突變體，其在小鼠體內顯示出抗炎特性，可改善脂質誘導的炎癥疾病[34]。基于ApoA-Ⅰ序列設計的模擬肽具有多種特性，包括合適的藥動學特征、低毒性、免疫原性以及良好的溶解性等。目前開發的短肽或模擬肽具有與ApoA-Ⅰ相似的抗動脈粥樣硬化、抗炎及抗氧化等保護作用，在膽固醇轉運過程中，部分模擬肽對ABCA1的特異性更高。細胞水平和動物模型實驗研究發現，部分ApoA-Ⅰ模擬肽能降低促炎黏附分子表達、中性粒細胞浸潤和氧化應激，進而發揮更好的抗動脈粥樣硬化效果。模擬肽的發現為開發治療動脈粥樣硬化的新方法以及設計減少心血管疾病發生的潛在藥物提供了新的策略，有助于他汀類藥物相關耐藥問題的研究，并減少他汀類藥物引發的藥物副作用。

3.2ApoA-Ⅰ模擬肽的抗動脈粥樣硬化作用 ApoA-Ⅰ模擬肽已作為治療藥物進行測試，包括全長ApoA-Ⅰ和ApoA-Ⅰ突變體，主要進行體外實驗和嚙齒類動物研究，大多數ApoA-Ⅰ模擬肽尚未進行人體臨床試驗[35]。目前ApoA-Ⅰ模擬肽主要有ApoA-Ⅰ模擬肽18A、5A、P12、4F、6F、FAMP等。

18A是ApoA-Ⅰ的A類α螺旋模擬肽，其疏水表面含有2個苯丙氨酸(F)殘基，也稱為2F[36]。5A是18A及其衍生物的脯氨酸相連的二聚體，易與磷脂結合形成類似HDL的結構[37]。以ApoA-Ⅰ第221～240位氨基酸殘基作為模板設計的模擬肽P12參與了ABCA1介導的膽固醇轉運，并可通過結合HDL提高RCT效率[33]。4F是目前研究最多的、最具代表性的ApoA-Ⅰ模擬肽，由苯丙氨酸殘基取代18A的第3位和第14位亮氨酸殘基而產生[38]。在臨床研究中，口服或腹腔注射4F表現出很強的抗動脈粥樣硬化特性[39]。4F的對映體L-4F和D-4F在體內外均具有良好的促進膽固醇外流活性[40]，且L-4F還能通過減少內皮細胞氧化損傷，顯著改善低密度脂蛋白受體敲除小鼠受損的血管舒張功能。6F(Tg6F)是一種很有潛力的ApoA-Ⅰ模擬肽，具有很強的抗動脈粥樣硬化、抗炎和抗氧化作用，不僅能夠克服其他多肽的不足，還能夠降低合成總成本[41]。Suematsu等[42]開發了一種不含磷脂的ApoA-Ⅰ模擬肽FAMP，并按劑量和反應時間合成新的ApoA-Ⅰ模擬肽i-FAMP-D1；與FAMP相比，i-FAMP-D1促進膽固醇外流能力更強。各種ApoA-Ⅰ模擬肽的氨基酸序列以及體內外生物學活性詳見表1。綜上所述，基于ApoA-Ⅰ結構的進一步模擬肽研究，將有助于新的抗動脈粥樣硬化藥物的研發。

表1 ApoA-Ⅰ模擬肽的氨基酸序列和抗動脈粥樣硬化作用

4 小 結

ApoA-Ⅰ及其模擬肽通過介導巨噬細胞膽固醇外流、增強RCT過程，并通過抗炎、抗氧化作用發揮抗動脈粥樣硬化特性，但ApoA-Ⅰ及其模擬肽與ABCA1之間相互作用的確切機制尚不清楚。目前，ApoA-Ⅰ及其模擬肽在動脈粥樣硬化性心血管疾病中的研究受到廣泛關注，針對動脈粥樣硬化斑塊中的炎癥巨噬細胞開發診斷和靶向治療藥物，對于動脈粥樣硬化的早期發現和治療具有重要的意義。通過探討ApoA-Ⅰ結構相關的區域活性，分析影響HDL功能的特定部位，有助于尋找開發模擬肽的活性序列/肽段，并更好地開發臨床治療動脈粥樣硬化性心血管疾病的潛在藥物。