超微腫痛貼對膝骨關節炎模型兔關節液IL-1β、IL-6及關節軟骨MMP-3、Ⅱ型膠原蛋白表達的影響*

馮帥華，文 哲，姚紅艷，姚順騫，張 淼，吳官保

（1.湖南省中醫藥研究院附屬醫院，湖南 長沙 410006；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；3.湘潭市中醫院，湖南 湘潭 411100）

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）又稱退行性膝骨關節炎，是一種最常見的退行性關節病，我國目前KOA的患病率約為18%，并且有逐年增加趨勢，女性多于男性[1]。目前KOA的發病機制尚不完全明確，但具有相似的病理學改變，主要為進行性關節軟骨的變性、破壞甚至缺損，軟骨下骨囊性變，骨贅形成等特點[2]。目前治療方案大體分為非手術治療和手術治療，中醫在非手術治療方面有較多的優勢，其中中醫外用膏劑外敷治療有簡單、方便并效果顯著的特點，已被廣泛應用于臨床。超微腫痛貼是湖南中醫藥研究院附屬醫院自制中藥外用膏劑，多種研究證實了其療效。對此，本研究借助病理學及分子生物學等技術手段，研究超微腫痛貼對膝骨關節炎模型兔的干預作用，旨在探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇3月齡普通級新西蘭實驗兔50只，體質量2.0～2.5 kg，雌雄各半，由湖南省中醫藥研究院動物實驗室提供，許可證號：SYXK（相）2015-0008。經檢疫后在湖南省中醫藥研究院動物實驗中心飼養，單籠喂養，適應性喂養1周后開始實驗。實驗方案得到湖南省中醫藥研究院實驗倫理委員會批準。

1.2 藥物與試劑 超微腫痛貼（含藥量：每100 cm2不少于7.5 g，規格：9 cm×7 cm）為湖南省中醫藥研究院附屬醫院院內制劑，由湖南省中醫藥研究院附屬醫院藥劑制備室生產，該方主要中藥材成分是：延胡索、大黃、菟絲子、熟地黃、川芎、當歸、沒藥、乳香、紅花、蒲黃、姜黃、莪術、白芷、梔子、香附、冰片。氟比洛芬巴布膏（澤普思，日本三笠制藥株式會社，國藥準字J20100007，批號：402194，規格：13.6 cm×10 cm）。木瓜蛋白酶（美國Genview公司，批號GX-6024）；蘇木素、伊紅（Wellbio公司，批號：UDT180015-1）；兔IL-1βELISA試劑盒（批號：20172011）、IL-6 ELISA試劑盒（批號：20171009）（南京森貝伽生物科技有限公司）；MMP-3、CollagenⅡ抗體（美國proteintech公司，批號：SA00001-2）；RIPA裂解液（中國長沙維世爾生物，批號：RA19060）；BCA蛋白定量試劑盒（Wellbio公司，批號：UDT180009-6）。

1.3 主要儀器BA210T顯微鏡（麥克奧迪實業集團有限公司）；YD-315型切片機（浙江金華益迪醫療設備有限公司）；BMJ-A型包埋機（常州中威電子儀器）；TS-92型搖床（中國江蘇其林貝爾儀器制造有限公司）；164-5050型電泳儀及電泳槽（美國Bio-rad公司）；TGL-18R型臺式冷凍離心機（珠海黑馬醫學儀器有限公司）；DYCZ-40A型轉膜儀（中國北京六一生物科技有限公司）；QL-901型漩渦混合器（中國江蘇其林貝爾儀器制造有限公司）；a85-1型磁力攪拌器（中國榮華）。

1.4 造模與分組 將50只新西蘭兔采用隨機數字表法分為空白組（12只）和造模組（38只），造模組新西蘭兔采用膝關節注射木瓜蛋白酶的方式復制兔膝骨關節炎模型。方法：刮除后肢右側膝關節周圍兔毛，微屈膝，由髕韌帶內側緣凹陷處進針，將5%木瓜蛋白酶注射到膝關節腔，0.1 mL/kg。于第1天、第3天、第5天各注射一次，并常規飼養4周后，可得到兔膝關節炎模型[3]。4周后，從38只造模組新西蘭兔中隨機抽取2只，采用空氣栓塞法處死，解剖右膝發現軟骨面暗淡、粗糙，取軟骨標本HE染色后光鏡下觀察發現，軟骨破壞、潮線欠流暢，提示造模成功。（見圖1）

圖1 造模組兔膝關節軟骨病理形態（HE，×40）

造模成功后將已造模的36只新西蘭兔隨機分為模型組、氟比洛芬巴布膏組、超微腫痛貼組，雌雄各半，每組12只。

1.5 實驗給藥 參照Meeh-Rubner法公式計算兔體表面積，然后用許文生氏公式計算我國國人體表面積，取人體表面積與兔體表面積比值（100∶7）得出兔膝骨關節超微腫痛貼用量大小為：2.39 cm×1.86 cm。造模4周后，開始予藥物干預。超微腫痛貼組兔予超微腫痛貼貼于右側膝關節（為防止撕咬及脫落，予醫用膠布及繃帶固定，固定后觀察兔的活動，以不影響正常活動為標準，防止影響局部血液循環，并每1 h巡查1次），1次/d，6 h/次，連續給藥4周。氟比洛芬巴布膏組兔予氟比洛芬巴布膏貼于右側膝關節，用量大小為3.60 cm×2.65 cm，以同樣的固定方法固定藥物，1次/d，6 h/次，連續給藥4周。空白組與模型組不進行任何干預，常規喂養4周。

1.6 取材及處理 治療4周后行空氣栓塞法處死4組兔，取材方法如下：（1）處死后首先在右側膝關節暴露髕上囊，在髕上囊處切開一小口，用注射器灌注滅菌生理鹽水1 mL，灌注后充分活動膝關節，擠壓并回抽收集關節液，上述操作反復3次，直至收集3 mL關節液。經離心后取上清液置于-20℃保存。（2）再打開關節囊，暴露膝關節腔，切斷交叉韌帶，清理半月板。然后離斷關節，取右側股骨內側髁進行清洗，經固定、沖洗、脫鈣、浸蠟、包埋、切片、HE染色等處理后，光鏡下觀察軟骨形態結構。（3）用刀片切取股骨外側髁關節面全層軟骨，并保存在液氮中，以進行Western blotting檢測。

1.7 觀察指標

1.7.1 光鏡下觀察軟骨形態學改變并進行Mankin’s評分 將軟骨切片進行HE染色后，在光鏡下進行形態學觀察，進行Mankin’s評分。評分標準見表1。

表1 Mankin’s評分標準

1.7.2 ELISA法檢測關節液中IL-1β、IL-6水平 將備好的關節液常溫化凍，用ELISA試劑盒嚴格按照產品說明書檢測關節液中IL-1β、IL-6的含量。

1.7.3 Western blotting法檢測軟骨中MMP-3、Ⅱ型膠原蛋白表達 取備用的兔膝關節軟骨，軟骨組織研磨后，并提取總蛋白，BCA法進行蛋白定量，隨后進行電泳分離，隨后轉移到NC膜上；用5%脫脂奶粉封閉1.5 h，將按照一定比例（MMP-3為1:750，Ⅱ型膠原為1:500，β-actin為1:5 000）稀釋的一抗溶液與膜一起孵育，保存在4℃冰箱中過夜；TBST洗3次后進行二抗孵育90 min；隨后用ECL化學發光液顯色并曝光，最后將曝光后底片進行掃描，用quantity one專業灰度分析軟件進行分析。

1.8 統計學方法 采用SPSS 25.0統計軟件對數據進行分析，計量資料采用（±s）表示，若滿足正態性和方差齊性，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，若方差不齊者用Tamhane’s T2法，若不滿足正態性采用非參數檢驗，以P〈0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組兔膝關節軟骨形態學改變情況 空白組兔膝關節軟骨表面平坦，軟骨層無裂紋，細胞數量及分布正常，大小正常，潮線無破壞；模型組兔膝關節軟骨層較空白組薄，軟骨出現較深裂隙，軟骨表面不平坦，軟骨細胞數量減少，或增多呈簇狀分布，潮線不平滑、中斷。氟比洛芬巴布膏組兔膝關節軟骨細胞增多，偶有呈簇狀分布，軟骨表面較模型組平坦，存在較多小裂隙，潮線欠流暢，偶有中斷。超微腫痛貼組兔膝關節軟骨細胞常規分布，軟骨表面相對平坦，存在小裂隙，潮線欠流。（見圖2）

圖2 各組兔膝關節軟骨病理形態圖（HE，×100）

Mankin’s評分結果：模型組、氟比洛芬巴布膏組及超微腫痛貼組兔膝關節軟骨Mankin’s評分明顯高于空白組（P〈0.05）；氟比洛芬巴布膏組及超微腫痛貼組兔膝關節軟骨Mankin’s評分明顯低于模型組（P〈0.05）；超微腫痛貼組兔膝關節軟骨Mankin’s評分低于氟比洛芬巴布膏組，但差異無統計學意義（P〉0.05）。（見表2）

表2 各組兔膝關節軟骨Mankin’s評分比較（±s，分）

表2 各組兔膝關節軟骨Mankin’s評分比較（±s，分）

注：與空白組比較，aP〈0.05；與模型組比較，bP〈0.05

組別 動物數（只） 評分結果空白組 12 0.75±0.45模型組 12 7.03±1.21a氟比洛芬巴布膏組 12 5.19±0.84a b超微腫痛貼組 12 5.08±0.91a b F 113.538 P 0.000

2.2 各組兔膝關節液中IL-1β、IL-6含量比較 模型組、氟比洛芬巴布膏組及超微腫痛貼組兔膝關節液中IL-1β、IL-6的含量明顯高于空白組（P〈0.05）；氟比洛芬巴布膏組及超微腫痛貼組兔膝關節液中IL-1β、IL-6的含量明顯低于模型組（P〈0.05）；超微腫痛貼組兔膝關節液中IL-1β、IL-6的含量低于氟比洛芬巴布膏組，但差異無統計學意義（P〉0.05）。（見表3）

表3 各組兔膝關節液中IL-1β、IL-6含量比較（±s，pg/mL）

表3 各組兔膝關節液中IL-1β、IL-6含量比較（±s，pg/mL）

注：與空白組比較，aP〈0.05；與模型組比較，bP〈0.05

組別 動物數（只）IL-1β IL-6空白組 12 15.71±3.34 11.76±2.67模型組 12 78.61±11.29a 66.51±10.66a氟比洛芬巴布膏組 12 62.13±11.60a b 53.33±8.14a b超微腫痛貼組 12 60.93±10.81a b c 51.69±9.17a b F 89.649 99.091 P 0.000 0.000

2.3 各組兔膝關節軟骨中MMP-3、Ⅱ型膠原蛋白表達情況 與空白組比較，模型組、氟比洛芬巴布膏組及超微腫痛貼組兔膝關節軟骨中MMP-3蛋白表達明顯上調（P〈0.05），Ⅱ型膠原蛋白表達明顯下調（P〈0.05）；與模型組比較，氟比洛芬巴布膏組及超微腫痛貼組兔膝關節軟骨中MMP-3蛋白表達明顯下調（P〈0.05），Ⅱ型膠原蛋白表達明顯上調（P〈0.05）；與氟比洛芬巴布膏組比較，超微腫痛貼組兔膝關節軟骨中MMP-3蛋白表達略下調，Ⅱ型膠原蛋白表達略上調，但差異均無統計學意義（P〉0.05）。（見圖3、表4）。

圖3 各組兔膝關節軟骨中MMP-3、Ⅱ型膠原蛋白表達Western blotting圖

表4 各組兔膝關節軟骨中MMP-3、Ⅱ型膠原蛋白表達比較（±s）

表4 各組兔膝關節軟骨中MMP-3、Ⅱ型膠原蛋白表達比較（±s）

注：與空白組比較，aP〈0.05；與模型組比較，bP〈0.05

組別 動物數（只）MMP-3 Ⅱ型膠原空白組 12 0.17±0.04 0.91±0.13模型組 12 0.58±0.10a 0.25±0.06a氟比洛芬巴布膏組 12 0.47±0.08a b 0.44±0.08a b超微腫痛貼組 12 0.44±0.09a b c 0.46±0.09a b F 55.724 107.382 P 0.000 0.000

3 討 論

現代醫學認為炎性因子、細胞合成及代謝因子、激素等與KOA發病關系密切[4]。KOA發病及病情進展涉及多種病理生理學改變，其中包括軟骨細胞凋亡[5]、炎性因子促炎反應[6]、軟骨細胞外基質的降解[7]等因素。其中關節軟骨基質合成與降解失衡是軟骨變性的重要因素,軟骨基質的過度降解、丟失是OA病情進展中的共同性特征之一。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是降解其細胞外基質的主要酶系[8]，其中MMP-3是基質溶解素，不僅參與間質膠原酶的激活，引起Ⅱ型膠原降解,而且可以激活明膠酶及多種絲氨酸蛋白酶，從而引起瀑布效應,對軟骨造成進行性破壞[9-10]。炎性細胞因子與OA也有密切關系，研究發現OA病變程度與IL-6、IL-1β、TNF-α等細胞因子的水平有直接關系[11-12]。IL-1β不僅可以增加巨噬細胞的浸潤，促進局部炎癥，并促進MMPs的表達，也可介導軟骨細胞的凋亡[13]。IL-6具有加重關節炎癥反應、上調MMPs及刺激破骨細胞活化等作用[14]。

中醫古籍中，無膝骨關節炎病名，現代中醫根據發病的部位命名為“膝痹”。本病的發生與多種因素有關，中醫認為膝骨關節炎發病與肝腎虧虛，風、寒、濕及瘀血客于局部有關，最終導致局部氣滯血瘀，經脈痹阻不通而發病。其主要病機是“虛、瘀、毒”[15]，虛主要是肝腎虧虛，筋骨失養；瘀主要是氣滯血瘀，寒凝瘀滯；毒主要是外來之風、寒、濕等邪氣，本病主要以肝腎虛為本，外感邪氣及氣滯血瘀為標。在治療痹證上，中醫根據辨證，合理運用活血化瘀、祛風除濕、補益肝腎等藥物[16]。中醫在治療膝骨關節炎有較多的優勢，其中中醫外用膏劑貼敷治療因有方便、顯效的特點，在臨床上廣泛運用。

超微腫痛貼是湖南省中醫藥研究院附屬醫院的自制中藥外用膏劑，是蔡光先教授經驗方“腫痛消”的改革劑型。超微腫痛貼方中延胡索能行血中氣滯，故專治一身上下諸痛，味辛則氣血能潤能散，具有活血行氣止痛的功效；方中大黃主取活血逐瘀之功，延胡索與大黃配伍活血祛瘀、行氣止痛，共為君藥；熟地黃及菟絲子配伍主要起補益肝腎之功，當歸主起活血止痛之效，兼養血調經；川芎亦然行氣、又能活血，可行一身之氣，為“血中之氣藥”，并具有祛風止痛之效，共為臣藥。香附理氣止痛，紅花、姜黃、蒲黃行血祛瘀，乳香與沒藥兩者配伍加強方中活血行瘀、消腫止痛之功，莪術破血行氣，白芷散寒止痛，梔子清熱利濕，共為佐藥，可助君藥活血祛瘀、行氣止痛之功；冰片辛香，通諸竅經絡，引諸藥行于經脈，為使藥。諸藥合用，共奏活血化瘀、行氣消腫止痛、補益肝腎之功效，可標本兼治。現代藥理研究中發現，方中延胡索及大黃兩味君藥的主要成分有良好的抑制炎性因子表達[17-18]、鎮痛[19]等效果。課題組在前期的臨床研究中發現超微腫痛貼在治療膝骨關節炎中可有效地改善臨床癥狀[20-21]，并且研究中證實了[22-25]降低P物質、OPN、1L-1β、TNF-α為其作用機制之一。傳統散劑制作的外用膏劑中藥材粒徑大，因此溶出速率、溶出度及吸收率相對低，而超微腫痛貼運用的超微飲片將藥材粒徑降低了幾十至近百倍，一般微粉粒徑控制在1～75μm，在保持傳統中藥固有的藥理化學成分的基礎上，提取、濃縮等處理后增加了載藥量、提高了透皮效果，并且增加了藥物有效接觸面積。

本實驗設計中因新西蘭兔的生理特性，膝關節液量少，無法達到直接收取的量，因此采用灌洗采取法[26-27]。氟比洛芬作為臨床上常用的抗炎止痛藥物，以往研究發現[28]，其有明顯的降低CRP、IL-6、TNF-α等炎性因子的作用，并且在臨床研究多次被證實，有良好的治療KOA的作用[29-30]。

本次實驗研究發現，超微腫痛貼及氟比洛芬巴布膏均可減少兔膝骨關節炎模型的關節液中IL-6、IL-1β水平，下調關節軟骨中MMP-3蛋白表達，上調Ⅱ型膠原蛋白表達。通過實驗結果可以推斷超微腫痛貼可能是通過減少IL-6、IL-1β釋放，抑制MMP-3表達，上調Ⅱ型膠原蛋白表達，進而保護關節軟骨，這可能為其治療KOA的作用機制之一，為超微腫痛貼防治KOA提供了部分實驗依據。但超微腫痛貼組方藥物較多，其有效成分及具體作用機制仍需進一步通過實驗探索證實。