尋常型銀屑病三種中醫證型外周血單核細胞基因芯片與miRNA芯片關聯分析*

盧 月，亓 篧，陳曲波，韓 凌,3，郜恒駿，盧傳堅,3

（1.廣州中醫藥大學第二附屬醫院，廣東 廣州 510006；2.生物芯片上海國家工程研究中心，上海 201203；3.廣東省中醫證候臨床研究重點實驗室，廣東 廣州 510006）

銀屑病是一種慢性遷延、易反復發作的皮膚炎癥性疾病。世界衛生組織（WHO）2016年報告全球銀屑病患病率在0.09%到11.43%之間[1]，我國發病率近25年間由0.12%增長至1.49%，銀屑病已成為危害公共健康的常見疾病[2]。銀屑病在治療上存在諸多缺陷，往往緩解期短，易復發，易耐受，且大多數藥物都存在相當的毒副作用。中醫學在治療銀屑病方面具有獨特的理論體系，長期以來積累了豐富的臨床經驗。中醫證候是中醫學臨床與基礎的核心，是中醫藥現代化研究中的重要內容。課題組對1979—2010年尋常型銀屑病文獻證候分布情況進行分析，發現尋常型銀屑病患者所有證型中，排前3位的證候血熱證（32.86%）、血燥證（23.56%）、血瘀證（19.43%），累計共占75.85%；并且血瘀證與穩定期相關，消退期與血燥證相關[3-4]。

本課題通過基因表達譜芯片和miRNA芯片技術，對銀屑病三種常見中醫辨證分型患者的外周血單核細胞基因表達水平和miRNA表達水平進行分析，對差異表達基因和miRNA進行關聯分析，從基因和miRNA水平揭示銀屑病不同證型的微觀物質基礎。

1 資料與方法

1.1 納入標準 符合尋常型銀屑病診斷標準[5]，中醫證型診斷符合白疪證型診斷[6]；簽署知情同意書。

1.2 排除標準 妊娠或哺乳期婦女；近半年內服用過類固醇藥物和/或服過維甲酸類藥物或用過生物制劑；1個月內外用過類固醇制劑或維甲酸類乳膏；合并有甲狀腺功能亢進、心血管、腦血管、肝、腎和造血系統等原發性疾病和精神病患者，以及長期服藥的患者；多種中醫證型夾雜的患者。

1.3 研究對象 所有患者均來源于廣東省中醫院皮膚科門診和病房。經本院倫理委員會批準。尋常型銀屑病組：共62例，其中血熱證16例，血瘀證23例，血燥證23例；男44例，女18例；平均年齡45.5歲（19～60歲），病程1個月至10年。健康對照組：共10名，均為門診體檢健康者，性別和年齡與銀屑病組相匹配。

1.4 儀器及試劑TRI Reagent（德國Sigma公司，貨號：T9424），miRNeasy Micro試劑盒（德國QIAGEN公司，貨號：217084），RNase-Free DNase Set（德國QIAGEN公司，貨號：79254），Affymetrix表達譜配套試劑盒GeneChipRWT PLUS試劑盒（美國Affymetrix公司，貨號：902280)，GeneChipR雜交洗脫染色試劑盒（美國Affymetrix公司，貨號：900720），滾動雜交爐（美國Affymetrix公司，貨號：00-0331-220V），洗滌工作站450DX2（美國Affymetrix公司，貨號：00-0335），數據采集軟件Command Console Software 3.1（美國Affymetrix公司），數據分析軟件Transcriptome Analysis console Software（美國Affymetrix公司）；Agilent Bioanalyzer 2100電泳儀（美國Agilent公司）；芯片掃描儀GeneChipRScanner 3000DX2（美國Affymetrix公司，貨號00-0334）；本實驗選用芯片為Affymertix公司的GeneChipRclariom D基因芯片和Agilent Human miRNA，Release 21.0（8*60K,Design ID：070156）芯片。

1.5 標本采集及處理 采集肘靜脈血10 mL于含有肝素的抗凝管中，按照試劑盒說明書分離外周血單核細胞（PBMC），置-80℃冰箱保存。

1.6 RNA的抽提與質檢 根據Sigma提供的標準操作流程,采用TRI Reagent對樣本總RNA進行抽提，進而使用miRNeasy Micro試劑盒和RNase-Free DNase Set純化總RNA。在質檢評斷合格后，純化后的總RNA，經Agilent Bioanalyzer 2100電泳儀評估RNA的完整性。

1.7 基因芯片實驗 本研究采用Affymetrix表達譜配套試劑盒GeneChipRWT PLUS試劑盒，按照生產廠商規定的標準操作流程對樣品總RNA中的mRNA進行體外反轉錄擴增，同時用生物素（biotin）標記cRNA。

按照Affymetrix芯片雜交流程，把生物素標記的cRNA加入盒式芯片中，按照表達譜芯片配套提供的雜交標準流程使用配套試劑盒，在45℃滾動雜交爐中滾動雜交16 h，雜交完成后在洗滌工作站按照標準操作流程進行芯片的洗滌。

芯片結果采用芯片掃描儀GeneChipRScanner 3000DX2進行掃描，用Command Console Software 3.1軟件讀取原始數據，質控合格的數據采用Command Console Software 3.1軟件進行歸一化處理，使用Gene level_SST_RMA算法對數據進行質控并出具數據報告，采用Transcriptome Analysis console軟件進行初步的基因差異表達分析。篩選P〈0.05，fold change≥2的差異基因，利用DAVID進行富集，選擇P〈0.05的通路進行分析。

1.8 miRNA芯片實驗 本研究使用的芯片為Agilent Human miRNA,Release 21.0（8*60K，Design ID：070156）芯片，樣品總RNA利用NanoDrop ND-2000（Thermo Scientific）定量并經Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)檢測RNA完整性。RNA質檢合格后，參照芯片標準流程進行樣本的標記、芯片的雜交以及洗脫。

采用Feature Extraction軟件（version10.7.1.1,Agilent Technologies）處理原始圖像提取原始數據。利用t檢驗的P值和倍數變化值進行差異miRNA篩選，篩選的標準為上調或者下調倍數變化值≥2.0且P≤0.05。接著，利用3個數據庫（Targetscan，microRNAorg，pita）共同對差異miRNA進行靶基因預測，接著對靶基因進行GO和KEGG富集分析，以判定差異miRNA主要影響的生物學功能或者通路。

根據表達譜芯片的差異基因分析結果，miRNA芯片差異miRNA及靶基因預測結果，利用DIANA在線工具及其數據庫對基因芯片和miRNA芯片結果進行關聯分析和維恩分析。

2 結 果

2.1 銀屑病不同證型患者和健康人的表達譜芯片與miRNA芯片結果關聯分析 我們根據銀屑病不同中醫證型患者和健康人miRNA芯片差異miRNA的靶基因預測結果，將表達譜分析的差異基因與miRNA芯片分析的差異miRNA按照差異改變負相關的關系進行關聯分析。結果表明，銀屑病血熱證患者和健康人的差異miRNA包括hsa-miR-136-5p、hsa-miR-144-3p和hsa-miR-485-3p；銀屑病血燥證患者和健康人的差異miRNA包括hsa-miR-1-3p、hsa-miR-136-5p、hsa-miR-144-3p和hsa-miR-485-3p；銀屑病血瘀證患者vs健康人的差異miRNA包括hsa-let-7c-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-146a-5p等21個。（見表1～3）

表1 銀屑病血熱證患者和健康人差異miRNA與靶向差異基因

表2 銀屑病血燥證患者和健康人差異miRNA與靶向差異基因

表3 銀屑病血瘀證患者和健康人差異miRNA與相關聯差異基因

2.2 三種銀屑病中醫證型與健康人關聯分析差異miRNA篩選共有差異miRNA，將三種證型與健康人的差異基因和差異miRNA進行關聯分析后，對各證型關聯分析后miRNA和基因的差異倍數都≥1.2倍的miRNA進行韋恩分析，經分析得到共有差異miRNA為hsa-miR-485-3p。（見圖1）

圖1 三種銀屑病中醫證型患者與健康人關聯分析差異miRNA

2.3 三種銀屑病中醫證型與健康人關聯分析差異基因 篩選出的共有差異基因分析按照上述分析方法，將各證型關聯分析后miRNA和基因的差異倍數都≥1.2倍的差異基因進行維恩分析。結果表明，三種證型的共有差異基因為miR-485-3p的靶基因RBMS1和FAM98B。（見圖2）

圖2 三種銀屑病中醫證型患者與健康人關聯分析差異基因

2.4 三種銀屑病中醫證型存在靶標關系的特有差異miRNA和基因分析 關聯分析和韋恩分析結果表明血瘀證存在靶標關系的特有差異miRNA和基因共142對，血燥證存在靶標關系的特有差異miRNA和基因共15對，而血熱證不存在證型特有差異miRNA。

3 討 論

銀屑病疾病分期一般分為進行期、穩定期和消退期，與銀屑病常見三種中醫證型相對應。血熱證多處于銀屑病進行期，血熱熾盛或外受毒熱刺激，而致血熱生風，風盛化燥，故皮損潮紅脫屑，伴瘙癢，并口干、心煩、易怒，大便秘結，小便赤黃。血瘀證多處于穩定期，且病程長，濕毒內滯，氣滯血瘀。此時皮損為暗紅色，呈斑塊狀并肥厚，或呈苔蘚樣變，有明顯浸潤，伴瘙癢。血燥證多處于消退期，熱毒蓄久，傷陰耗血所致。此時皮損顏色淡紅，鱗屑少，伴瘙癢，并咽干、口干、大便秘結[7]。本課題通過基因表達譜芯片和miRNA芯片，在基因和miRNA表達水平對銀屑病常見三種中醫證型進行分析，并將結果進行關聯，得到三種中醫證型共有差異miRNA，以及可能是其作用靶點的差異基因。

經關聯分析和韋恩分析，結果表明血瘀證組存在靶標關系的特有差異miRNA和基因共159對，血燥證組存在靶標關系的特有差異miRNA和基因共16對，而血熱證組不存在證型特有差異miRNA。SLA2與其調控的hsa-miR-26b-5p是血瘀證組存在靶標關系的特有差異miRNA和基因之一。SLA2（Src like adaptor 2，又名SLAP-2）是主要在造血細胞中表達的銜接蛋白。在T細胞中，SLAP-2與幾種酪氨酸磷酸化蛋白相結合，通過與泛素連接酶c-Cbl的相互作用負性調節T細胞抗原受體下游信號傳導[8]。此外，hsa-miR-26b-5p與代謝調節、糖尿病相關[9]。WASL與hsa-miR-1-3p是血燥證組存在靶標關系的特有差異miRNA和基因。WASL（WASP like actin nucleation promoting factor，又名N-WASP）在細胞遷移、免疫炎癥反應中發揮重要作用，該基因可以通過調控NF-kB和MAPK信號通路進而影響牙齦成纖維細胞中炎癥細胞因子的表達[10]。并且，WASL可以調控IL-23在角質形成細胞中的表達，進而影響慢性皮膚炎癥的發生[11]。hsa-miR-1-3p與其靶基因作用，參與系統性紅斑狼瘡等免疫性疾病的發生[12]。

經分析得到三種中醫證型共有差異miRNA為hsa-miR-485-3p。研究表明，miR-485-3p通過下調Top2α的表達，調控核因子-YB影響DNA拓撲異構酶Ⅱα的表達和藥物反應性[13]。此外，miR-485-3p是盤狀皮膚紅斑狼瘡發病機制中的調控因子，通過調節炎癥介質的產生，從而促進盤狀皮膚紅斑狼瘡病變中的皮膚炎癥，說明miR-485-3p與皮膚免疫炎癥密切相關[14]。RBMS1（RNA Binding Motif single stranded interacting protein 1）是結合單鏈DNA/RNA的小蛋白家族成員，參與DNA復制與細胞周期調控。RBMS1能夠特異性結合C-myc基因上游的復制起始區[15]，調控C-myc表達，調控銀屑病表皮角質形成細胞的增殖與分化。此外，RBSM1可通過IL-6/STAT3信號通路促進胃癌細胞的侵襲轉移[16]。研究[17]表明，與健康人比較，血熱證銀屑病患者皮損中JAKl/STAT3信號通路活化程度顯著升高，下游因子C-myc、VEGF表達量升高，同時高于血燥證和血瘀證患者，證型間的表達水平呈血熱證〉血瘀證〉血燥證的狀態。RBSM1是否通過JAKl/STAT3調控下游因子C-myc、VEGF的表達發揮影響三種證型狀態的機制還需要進一步深入研究。研究表明，中國漢族人群RBMS1基因rs7593730位點與代謝性疾病2型糖尿病具有顯著相關性，RBMS1和ITGB6基因2q24位點的突變人群具有2型糖尿病易感性[9]。研究[18]顯示，FAM98B與hCLE、DDX1、HSPC117形成復合物，在細胞核和細胞質之間穿梭以轉運RNA，在控制細胞核和細胞質RNA功能中發揮重要作用。FAM98B作為銀屑病三種證型中共有差異靶基因，其在銀屑病方面的作用還尚未報道。

本研究通過對尋常型銀屑病不同中醫證型患者外周血單核細胞的基因表達譜芯片與miRNA芯片結果進行關聯分析，得到銀屑病不同中醫證型的微觀物質基礎；并且發現miR-485-3p及其靶基因RBMS1和FAM98B有可能是參與銀屑病發生的重要miRNA和基因。