基于網絡藥理學的腎炎康復片治療糖尿病腎病的潛在作用機制研究*

李寶華，陳剛毅

（1.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510405）

糖尿病腎病（diabetic nephropahty，DN）是導致慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）的主要病因之一[1]。目前西醫對DN仍缺乏特異性治療，治療手段主要包括一般治療及控制血糖、血壓、血脂等[2]，但具有一定的局限性。中醫學認為DN屬于“消渴”“虛勞”等范疇。一般認為，本病屬本虛標實，治法需兼顧標本[3]。腎炎康復片是名老中醫趙恩儉教授的經驗方，由西洋參、人參、熟地黃、鹽杜仲、山藥、白花蛇舌草、黑豆、土茯苓、益母草、丹參、澤瀉、白茅根、桔梗等13味中藥組成，具有益氣養陰、補腎健脾、清解余毒之效。研究表明，腎炎康復片在治療DN中可有效降低尿蛋白、改善腎功能[4]。現代藥理學研究證實，腎炎康復片可改變血液流變學、抑制炎癥反應[5]、減少細胞外基質積聚、修復受損足細胞、抑制腎小球系膜細胞增殖[6]等作用。

但目前腎炎康復片對DN的作用機制尚未完全明確。網絡藥理學是基于系統生物學的理論，通過對生物系統進行網絡分析，選取特定信號節點進行多靶點藥物分子設計的學科[7]。借助網絡藥理學的方法分析中成藥對疾病的干預和影響，可用于初步篩選中藥有效成分、作用靶點及作用機制，減輕后續實驗的工作量及風險。本研究擬基于網絡藥理學，通過數據檢索、挖掘和篩選，構建“中藥復方-化學成分-靶點-疾病”網絡，以闡釋腎炎康復片治療DN的主要化學成分及可能的分子機制，為后續的實驗和臨床研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 腎炎康復片所含主要化學成分的查詢和篩選 通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，http://tcmspw.com/tcmsp.php），輸入腎炎康復片所含的中藥名稱，即西洋參、人參、熟地黃、杜仲、山藥、白花蛇舌草、黑豆、土茯苓、益母草、丹參、澤瀉、白茅根、桔梗，檢索得到各味中藥所含的化學成分。主要化學成分的篩選主要根據機體對藥物的吸收、分布、代謝及排泄過程進行評價，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18作為主要化學成分的篩選標準，以判斷其對人體的影響和風險[8-9]。另結合中國知網、萬方、PubMed等文獻數據庫對于未從平臺中檢索出，但具有明確藥理作用的活性化學成分也納入候選主要化學成分，并進行后續研究。

1.2 腎炎康復片主要化學成分潛在作用靶點收集 通過TCMSP平臺檢索腎炎康復片主要化學成分的潛在靶點，并使用Uniprot數據庫（https://www.uniprot.org/，更新于2018年5月25日）對靶點進行注釋，限定物種為“Homo sapiens(Human)”，剔除非人源靶點，獲得靶點的標準基因名。使用Cytoscape 3.7.2構建“主要化學成分-作用靶點”的網絡圖。

1.3 DN疾病靶點的獲取 通過GeneCards（https://www.genecards.org/）、在線人類孟德爾遺傳數據庫（online mendelian inheritance in man，OMIM，https://omim.org/）、疾病靶點數據庫（therapeutic target database，TTD，http://db.idrblab.net/ttd/）和Drugbank數據庫（https://www.drugbank.ca/），檢索關鍵詞“Diabete Kidney Disease”“Diabete Nephropathy”“nephropathy，diabetic”以獲取與DN相關的靶點，并整理建立DN相關的靶點數據集。

1.4 腎炎康復片作用靶點與DN靶點集的網絡構建 將腎炎康復片主要化學成分的潛在作用靶點與DN相關的靶點取交集，并使用R語言VennDiagram version 1.6.20軟件繪制韋恩圖。將交集的靶點導入注釋、可視化和集成發現數據庫（the database for annotation,visualization and integrated discovery，DAVID，https://david.ncifcrf.gov/），限定物種為“Homo sapiens”，獲得靶基因名的官方名稱。使用Cytoscape 3.7.2構建“中藥復方-主要化學成分-作用靶點-疾病”的網絡圖，顯示中藥復方主要化學成分與DN疾病靶點的關系。

1.5 蛋白質相互作用（PPI）網絡構建與關鍵靶點篩選分析 將腎炎康復片與DN的共有靶點上傳至STRING平臺（https://string-db.org/），限定物種為“Homo sapiens”，初步建立藥物靶蛋白-疾病靶蛋白相互作用網絡。設定篩選條件為最低限度的互動分數≥0.900[10]，獲得藥物靶蛋白-疾病靶蛋白相互作用的信息及網絡圖。采用Cytoscape 3.7.2軟件插件cytoNCA對蛋白相互作用網絡進行拓撲分析，分析內容包括度中心性（degree centrality，DC）、中介中心性（betweenness centrality，BC）、緊密中心性（closeness centrality，CC）和特征向量中心性（eigenvector centrality，EC）等，以篩選出網絡中的關鍵靶點。這些靶點與其他更多靶點擁有相互作用關系，且作用效率更高。設定篩選標準為節點的DC值高于全部節點DC值中位數2倍，且BC、CC、EC值均大于所有節點的中位數，篩選出的節點即為關鍵靶點[11-12]。將獲得的靶點再次通過STRING平臺構建PPI網絡圖，設定篩選條件為最低限度的互動分數≥0.400[13]。并通過Cytoscape 3.7.2軟件挖掘關鍵靶點與其對應的化學成分及中藥藥物的關系。

1.6 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析 通過Cytoscape 3.7.2軟件插件GlueGO v2.5.5對腎炎康復片治療DN的潛在關鍵靶點進行基因功能富集分析和通路富集分析。功能富集分析通過基因本體論（gene ontology，GO）數據庫進行，分別從分子生物學功能（molecular function，MF）、生物學過程（biological process，BP）和細胞學組分（cellular components，CC）3個功能大類進行富集分析，從而對一個基因的功能進行多方面的描述和分析。通路富集分析通過京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數據庫進行，從而獲得基因作用通路的相關信息，研究腎炎康復片治療DN可能的作用機制。富集分析所獲得的P值均使用Bonferroni方法進行校正，以P<0.05為篩選條件，并根據P值從小到大進行排序，選取功能富集分析前20個生物過程及通路富集分析前20條通路，上傳至進步源自共享云平臺（Omic－Share，https://www.omicshare.com/tools/）進行數據可視化處理。

2 結 果

2.1 腎炎康復片主要化學成分及其潛在靶點的收集和篩選 從TCMSP平臺上檢索出腎炎康復片13味中藥的化學成分，其中西洋參11種、人參22種、熟地黃2種、杜仲28種、山藥16種、白花蛇舌草7種、黑豆13種、土茯苓15種、益母草8種、丹參65種、澤瀉10種、白茅根33種、桔梗7種，剔除重復成分，并補充文獻已報道具有明確藥理作用的活性成分后，統計得腎炎康復片化學成分共有211種。根據OB≥30%、DL≥0.18篩選后得出主要化學成分共183種（見表1，由于篩選結果過多，因此僅列出OB值前15項及各味中藥中OB值最大項，共20項）。研究較多的如丹參的主要活性成分丹酚酸、丹參酮，以及人參的主要活性成分人參皂苷等亦在此列。將183種主要化學成分輸入TCMSP平臺，檢索出潛在藥物潛在靶點共320個。通過Uniprot數據庫對靶點進行篩選和注釋，剔除非人源靶點后共獲得267個藥物潛在靶點及其標準基因名。通過Cytoscape 3.7.2獲得“中藥-化學成分-作用靶點”的網絡圖，共獲得430個節點、3 464條邊。從圖中可見，不同中藥之間可擁有共同的化學成分，而不同化學成分也可對應同一作用靶點，說明腎炎康復片是通過不同中藥之間、多種成分及多種靶標之間協同發揮作用。（見圖1）

圖1 腎炎康復片“中藥-化學成分-作用靶點”相互作用網絡圖

表1 腎炎康復片部分主要化學成分的基本信息

2.2 DN疾病靶點的獲取和整理 通過GeneCards、OMIM、TTD和Drugbank數據庫獲得與DN相關的靶點基因，分別收集到10 661、1 257、20、44個疾病靶點。剔除重復后獲得DN相關的靶點基因共11 584個，包括血管緊張肽轉換酶（Angiotensinconverting enzyme，ACE）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1A9（UDP-glucuronosyltransferase 1-9，UGT1A9）、血管緊張素Ⅱ受體1（Type-1 angiotensinⅡreceptor，AGTR1）等。

2.3 腎炎康復片作用靶點與DN靶點集的網絡構建 將腎炎康復片主要化學成分的267個靶點與DN疾病相關的11 584個靶點取交集，得到腎炎康復片作用在DN的潛在靶點258個。通過VennDiagram v1.6.20軟件獲得韋恩圖。（見圖2）將258個潛在作用靶點基因導入DAVID數據庫獲得其官方名稱后，通過Cytoscape 3.7.2獲得腎炎康復片與DN的“中藥復方-主要化學成分-作用靶點-疾病”的網絡圖，共獲得407個節點，1 893條邊。（見圖3）

圖2 腎炎康復片與DN靶點韋恩圖

圖3 腎炎康復片與DN的“中藥復方-化學成分-作用靶點-疾病”關系網絡圖

2.4 PPI網絡構建與關鍵靶點篩選分析 將腎炎康復片作用在DN的潛在258個靶點上傳至STRING平臺后得出腎炎康復片靶蛋白-DN疾病靶蛋白相互作用信息及PPI網絡圖。（見圖4A）通過cytoNCA計算網絡各節點的DC、BC、CC和EC值，得出網絡所有節點的DC值中位數為7，BC值中位數為94.242 287，CC值中位數為0.072 18，EC值中位數為0.025 797 702 5。根據“1.6”的篩選方法，得出43個關鍵靶點，包括信號轉導與轉錄激活因子3（Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、絲裂原活化蛋白激酶3（Mitogen-activated proteinkinase 3，MAPK3）、轉錄因子AP-1（Transcription factor AP-1，JUN）等。（見表2）通過STRING平臺獲得43個關鍵靶點的PPI網絡圖。（見圖4B）通過Cytoscape 3.7.2繪制此43個關鍵靶點與腎炎康復片的化學成分和中藥之間的關系網絡圖，共獲得172個節點，466條邊。（見圖5）其中可見細胞核受體共激活劑2（Nuclear receptor coactivator 2，NCOA2）、維甲酸X受體α（Retinoic acid receptor RXR-alpha，RXRA）、細胞核受體共激活劑1（Nuclear receptor coactivator 1，NCOA1）等對應的化學成分較多；而丹參、杜仲、人參、山藥、黑豆等與這43個關鍵靶點擁有較多聯系。

圖4 腎炎康復片-DN潛在靶點（A）和關鍵靶點（B）PPI網絡圖

圖5 腎炎康復片與DN的“中藥-相關化學成分-關鍵靶點”關系網絡圖

表2 腎炎康復片治療DN的關鍵靶點及其基本信息

2.5 GO生物功能富集分析和KEGG通路富集分析 通過GlueGO v2.5.5對腎炎康復片治療DN的43個關鍵靶點進行GO生物功能富集分析和KEGG通路富集分析。通過GO富集分析共獲得332個生物過程，其中涉及BP有306個、涉及MF有58個、涉及CC有3個，包括對脂多糖的應答（response to lipopolysaccharide）、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子的結合（RNA polymeraseⅡ-specific DNA-binding transcription factor binding）、對機械刺激的應答（response to mechanical stimulus）等生物過程。（見圖6）通過KEGG富集分析共獲得122個通路，主要涉及AGE-RAGE信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in di－abetic complications）、IL-17信號通路（IL-17 signaling pathway）、Toll樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）等，表明腎炎康復片可通過多個生物過程和多個通路的協調和相互作用以治療DN。同時從富集分析中可看出這些靶點基因與卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、人巨細胞病毒感染、乙型病毒性肝炎等疾病相關。（見圖7）

圖6 腎炎康復片治療DN的43個關鍵靶點GO生物功能富集分析（前20位）

圖7 腎炎康復片治療DN的43個關鍵靶點KEGG通路富集分析（前20位）

3 討 論

DN是糖尿病常見的微血管并發癥之一，已成為全球主要的健康問題。目前DN的發病機制尚未完全明確，西醫對DN仍缺乏特異性治療。有研究表明，DN的發病與糖尿病環境導致晚期糖基化終產物的產生并參與循環、生長因子的產生、血流動力學和激素水平的變化有關，進而引起活性氧物質和炎癥介質的產生和釋放，造成腎臟發生病理變化。內質網應激、自噬、外泌體的活動[14-17]等與DN發病也有關。

中醫學認為，隨著DN病情發展，其病機及證型有所變化，其中以氣陰兩虛最為常見，同時兼雜血瘀、濕熱、水濕、痰濁等，病位主要在腎、脾[18]，因此治法多以益氣養陰、補益脾腎為主，同時注重祛瘀化痰、利水泄濁。腎炎康復片的組方正好體現出這一治則。方中熟地黃益腎補精，養血滋陰，為君藥；杜仲補益肝腎，黑豆補腎益陰利濕，人參、西洋參、山藥健脾益氣養陰，白花蛇舌草、土茯苓清熱解毒，共為臣藥；丹參、益母草活血化瘀，白茅根清熱利水，澤瀉利水滲濕，為佐藥；桔梗宣肺利氣，為使藥。諸藥合用，補益而不燥膩，清利而不傷損，扶正兼顧袪邪，攻補并舉。

研究顯示腎炎康復片聯合西醫常規療法在DN治療中優于單純西醫療法[4,6]。腎炎康復片具有減少血液中IL-6、TNF-α等因子水平，減輕腎臟炎癥狀態[19]；改善DN環境下的高黏、高凝的血液流變學狀態，增加腎組織血液灌注；調節腎臟組織細胞增殖和凋亡[20]等作用，對DN治療有多通路、多靶點、多功效的特點。但目前其具體的作用成分及靶點尚未明確。

本研究通過網絡藥理學分析發現，與腎炎康復片13味藥相關的化學成分共有211種，篩選后得出183種的主要化學成分，包括薯蕷皂苷元、葉酸、前益母草乙素、多種結構的丹參酮、丹酚酸、人參皂苷等。薯蕷皂苷元來自山藥和土茯苓，可改善腎臟炎癥狀態、減輕氧化應激水平等作用以減輕腎臟纖維化[21]。葉酸來自黑豆，其可通過促進同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）代謝，抑制由于Hcy的增加引起的腎小球內氧化應激和炎癥反應及腎臟微循環障礙，對DN起治療作用[22]。丹參的活性成分丹酚酸，可減輕腎臟組織炎癥和增生反應，延緩腎臟纖維化進程；丹參酮可促進葡萄糖的攝取，減輕大鼠腎小管細胞壞死及凋亡，并能抑制氧化應激介導的腎損傷[23]。

通過將腎炎康復片主要化學成分的作用靶點與DN的相關靶點進行匹配，獲得258個共同靶點。進一步進行網絡拓撲分析及PPI網絡構建獲得43個關鍵靶點，說明腎炎康復片中的有效成分可能是通過STAT、MAPK、IL、NFKBIA等藥物-疾病共有靶點網絡起作用。STAT參與的JAK/STAT通路與MAPK、NF-κB通路皆參與腎臟炎癥反應，通過激活IL-6、IL-8、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）等多種炎性因子，引起腎臟內巨噬細胞聚集，觸發免疫應答過程，造成腎臟損傷[24-25]。研究表明，腎炎康復片中的薯蕷皂苷元、葉酸等有效成分可通過抑制MAPK和NF-κB通路對腎臟起保護作用[21-22]。而與關鍵靶點關聯較多的中藥丹參，其有效成分如丹酚酸、丹參酮等亦可通過抑制MAPK次級的ERK1/2蛋白的表達，抑制腎小球細胞外基質的重構[23]。

對43個關鍵靶點進行GO生物功能富集分析發現，腎炎康復片治療DN所涉及的生物過程包括細胞應答（如對脂多糖、活性氧物質的應答）、細胞分裂分化（如白細胞的分裂分化）、蛋白質合成和轉運等方面，與臨床研究中腎炎康復片減輕DN中腎臟炎癥反應和氧化應激水平、修復腎臟損傷細胞等功效相對應。KEGG通路富集分析顯示，AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、Toll樣受體信號通路等可能是腎炎康復片發揮作用的主要通路。AGE-RAGE通路可通過激活MAPK、NF-κB、JAK/STAT等通路，激活腎臟的氧化應激和炎癥反應，引起腎臟損傷[26]。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）參與機體免疫反應，其中TRL4可通過激活NF-κB通路，介導腎臟炎癥反應、氧化應激和細胞破壞[27]。由此推測腎炎康復片可能通過下調高血糖、脂多糖、AGE等介導的上述通路活動對DN起治療作用。

本研究借助網絡藥理學，基于多成分、多靶點、多通路理論挖掘并分析腎炎康復片治療DN的潛在作用機制，為日后關于腎炎康復片治療DN更深入的基礎和臨床研究及中藥新藥研制提供一定的理論依據。但由于數據庫信息可能存在不全面、不及時更新等情況，篩選主要化學成分時僅根據其化學結構，忽略了成分的含量、成分間化學反應、成藥制備工藝對化學成分的影響等。因此本研究僅為從理論上借助數據庫及他人研究成果分析預測探討腎炎康復片治療DN的機制，尚需更多的基礎實驗和臨床研究以驗證本研究結果的合理性和相關性。