低氧預(yù)適應(yīng)血管內(nèi)皮細胞增加神經(jīng)細胞低氧耐受*

張 璞，劉曉蕾，邵 國

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014040；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)低氧轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室；3.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院低氧適應(yīng)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)北京市重點實驗室)

腦卒中具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高致死率和高致殘率的特點，嚴重威脅著人類的健康和生存質(zhì)量。缺血性腦卒中占腦卒中發(fā)病的85 %左右[1]。血管再通和神經(jīng)保護是治療缺血性卒中的兩組主要策略[2]。呂國蔚教授最早提出低氧預(yù)適應(yīng)(Hypoxic preconditioning，HPC)可以增加神經(jīng)細胞對低氧缺血耐受。遠隔缺血預(yù)適應(yīng)(Remote Ischemic Preconditioning，RIPC)是指通過非侵入方式對非重要器官(如肢體)的反復(fù)缺血刺激使重要器官(如腦)產(chǎn)生對缺血/低氧的耐受[3]。RIPC以其安全無創(chuàng)和簡單易行的特點成為治療缺血性卒中的具有良好臨床轉(zhuǎn)化前景的方法。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)RIPC血清外泌體中miR-126增加[4]，而miR-126為內(nèi)皮細胞特異的microRNA，據(jù)此推測RIPC過程中內(nèi)皮細胞分泌的物質(zhì)可以對神經(jīng)細胞產(chǎn)生保護作用。本研究利用體外培養(yǎng)的人微血管內(nèi)皮細胞(HMEC-1)，對其進行HPC后分離培養(yǎng)基(含內(nèi)皮細胞的分泌物質(zhì))，觀察HPC條件下內(nèi)皮細胞的分泌物質(zhì)對神經(jīng)細胞的保護作用，探討RIPC作用的可能細胞機制。

1 對象與方法

1.1實驗細胞 人神經(jīng)母細胞瘤細胞系(SH-SY5Y)購于中國科學(xué)院上海生科院細胞資源中心，人微血管內(nèi)皮細胞(HMEC-1)購于上海信裕生物科技有限責(zé)任公司。SH-SY5Y細胞培養(yǎng)于含有10 % FBS和0.6 %青鏈霉素的1640完全培養(yǎng)基中，HMEC-1細胞培養(yǎng)于HMEC-1完全培養(yǎng)基(購于上海信裕生物科技有限責(zé)任公司)，培養(yǎng)條件為37 ℃、21 % O2+5 % CO2+74 % N2。

1.2細胞模型構(gòu)建及分組

1.2.1構(gòu)建HMEC-1細胞低氧預(yù)適應(yīng)模型 HMEC-1在37 ℃、1 % O2、5 % CO2的條件下低氧30 min，然后在37 ℃、20 % O2、5 % CO2的條件復(fù)氧30 min，1次低氧和1次復(fù)氧算作一個循環(huán)，重復(fù)4次。收集HPC條件下的培養(yǎng)基(含HMEC-1細胞HPC條件下分泌物)，加入到SH-SY5Y細胞中作為HPC組；收集正常培養(yǎng)HMEC-1細胞的培養(yǎng)基，加入到SH-SY5Y細胞中作為培養(yǎng)基對照組(Medium-C組)，同時以正常SH-SY5Y細胞培養(yǎng)基加入到SH-SY5Y細胞中作為空白對照組(SY5Y-C組)。三個組均在37 ℃、1 % O2、5 % CO2的條件下進行低氧培養(yǎng)13 h，之后復(fù)氧6 h。

1.2.2MTS檢測細胞活力 以3 000個/孔的密度將SH-SY5Y細胞種入96孔板中,待細胞貼壁后，更換培養(yǎng)基，按照上述分組構(gòu)建模型,造模完成后每孔加入20 μL MTS溶液(Promega公司),充分混勻后37 ℃孵育4 h,期間每30 min用酶標儀檢測每孔在490 nm波長下的吸光值,并計算細胞活力。細胞活性計算公式為:細胞活性=[(處理組OD值-調(diào)零孔OD值)/(對照孔OD值-調(diào)零孔OD值)]×100 %。

1.2.3Western Blot檢測caspase-3蛋白表達水平 收集低氧13 h復(fù)氧6 h后的SY5Y-C組、Medium-C組以及HPC組細胞，RIPA裂解液中加入蛋白酶抑制劑勻漿處理，12 000 rpm，4 ℃離心提取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。每組取15 μg蛋白上樣液加入到8 % SDS-PAGE凝膠點樣孔中，電泳分離蛋白；然后將蛋白過夜轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5 %脫脂牛奶室溫封閉1.5 h,TBST洗膜3次,每次10 min；將洗好的膜在4 ℃條件下使用caspase-3一抗 (1∶1 000稀釋，CST)、β-actin一抗(1∶1 000稀釋，Santa)孵育過夜；室溫下用山羊抗兔和山羊抗小鼠抗體(金普萊)孵育1.5 h，TBST洗膜3次,每次10 min；ECL超敏發(fā)光液浸泡PVDF膜，化學(xué)發(fā)光儀(天能公司)掃描圖像并分析蛋白表達。

2 結(jié)果

2.1HPC血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基增加SH-SY5Y細胞低氧耐受 利用MTS檢測細胞活力。以正常SH-SY5Y細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)(未進行HPC處理)的SH-SY5Y細胞活力設(shè)為1，則SY5Y-C組、Medium-C組和HPC 組細胞的活力分別是(0.9967±0.0033)、(1.0751±0.0447)和(1.4737±0.0325)。結(jié)果顯示，正常培養(yǎng)基與培養(yǎng)HMEC-1細胞的培養(yǎng)基在低氧條件下對SH-SY5Y細胞活力的影響無明顯差異，而低氧預(yù)適應(yīng)處理后的HMEC-1培養(yǎng)基培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞活力顯著增加(P<0.05)，見圖1。

圖1 MTS檢測細胞活力

2.2HPC血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基降低SH-SY5Y細胞caspase-3水平 caspase-3水平代表了細胞凋亡。利用Western Blot檢測SY5Y-C組、Medium-C組和HPC 組細胞caspase-3水平。結(jié)果顯示，SY5Y-C組和Medium-C組細胞的caspase-3相對水平分別為(0.9950±0.0050)、(0.9893±0.0787)，HPC組細胞caspase-3蛋白水平為(0.8180±0.0361)，HPC組的caspase-3蛋白顯著降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 HPC血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基增加SH-SY5Y細胞對低氧的耐受

3 討論

大腦對低氧/缺血十分敏感[5]，低氧/缺血可造成大腦神經(jīng)損傷，引發(fā)神經(jīng)功能紊亂和機能喪失等[6]。低氧預(yù)適應(yīng)是一種內(nèi)源性的細胞保護機制，即組織或細胞預(yù)先經(jīng)過亞致死性的低氧刺激可以增加其對隨后的嚴重低氧刺激的耐受[7]。有研究表明，HPC可以通過減少神經(jīng)元死亡、激活微膠質(zhì)細胞并增強神經(jīng)生成來保護大腦免受低氧/缺血損傷[8]。但由于大部分HPC都是在整體或器官局部進行，很難進行臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

RIPC通過對肢體進行短暫的缺血訓(xùn)練，可以對遠離缺血部位的中樞神經(jīng)細胞產(chǎn)生保護作用。2016年，Nature Review Neurology發(fā)表綜述認為：“RIPC是一種有潛力的改善缺血性腦卒中預(yù)后的非藥物治療方法，其主要通過神經(jīng)、體液和免疫調(diào)節(jié)等途徑調(diào)動機體的內(nèi)源性保護機制，具有良好臨床轉(zhuǎn)化前景”[9]。但是RIPC神經(jīng)保護物質(zhì)的產(chǎn)生部位和傳遞方式到目前尚不明確。我們前期研究顯示RIPC血清外泌體可以對神經(jīng)細胞產(chǎn)生保護作用，而內(nèi)皮細胞來源的外泌體所攜帶的miR-126是增加低氧耐受的一種可能的分子機制[4]。本研究通過對體外培養(yǎng)的HMEC-1細胞進行HPC并分離其培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基可以增加低氧條件下神經(jīng)細胞SH-SY5Y的細胞活力并降低細胞凋亡分子caspase-3的水平。結(jié)果提示內(nèi)皮經(jīng)過HPC可以釋放神經(jīng)保護物質(zhì)，這可能是RIPC神經(jīng)保護的一種機制。

血管內(nèi)皮細胞位于血漿與血管組織之間，可以通過分泌一些生物活性物質(zhì)以達到對血管張力的調(diào)節(jié)，保證血管的收縮和舒張，與此同時內(nèi)皮細胞在維持血管完整性以及血管再生方面也發(fā)揮了重要作用[10]。有證據(jù)表明，神經(jīng)元和血管細胞在發(fā)育、結(jié)構(gòu)和功能上密切相關(guān)[11]。內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)基通過旁分泌因子促進培養(yǎng)的紋狀體細胞的增殖和再生，并增加神經(jīng)保護作用[12]。1.5 %的低氧處理內(nèi)皮祖細胞可誘導(dǎo)衍生因子釋放到培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基可以提高神經(jīng)元對糖氧剝奪的耐受[13]。本實驗中，HPC條件下血管內(nèi)皮細胞很可能是通過釋放神經(jīng)保護因子或信號來增加神經(jīng)細胞對低氧的耐受。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)HPC血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)基可以增加神經(jīng)細胞SH-SY5Y對低氧的耐受。本研究結(jié)果提示血管內(nèi)皮細胞釋放神經(jīng)保護因子可能是RIPC神經(jīng)保護的機制之一。