基于數(shù)據(jù)挖掘分析RASAL2在胃癌中的表達及其臨床意義

范文潔 陳象遜 周夢熙 羅薇薇 楊 林

胃癌是全球第5位常見腫瘤，也是造成癌癥死亡的第2位病因。在我國，胃癌的發(fā)病率和死亡率均居第2位，每年新增病例多達40萬，已經(jīng)成為威脅民眾健康的重大疾病之一。由于起病隱匿，多數(shù)患者在確診時已處于疾病晚期，治療效果多不理想。研究表明晚期或轉(zhuǎn)移性胃癌患者的中位生存期不足1年。由此可見，深入研究胃癌發(fā)生發(fā)展機制以及尋找潛在的防治靶標具有重要的理論與實際意義。類RAS激活物2(RAS protein activator like 2,RASAL2)是一種Ras-GTP酶活化蛋白(RasGTPase-activating protein,RasGAP)，隸屬于SynGAP家族，于1998年首次在前列腺癌中發(fā)現(xiàn)，基因定位于人類1號染色體長臂1q24-25。RASAL2參與了胰腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。然而，RASAL2是否參與胃癌發(fā)病以及影響胃癌患者預后尚無報道。因此，本研究基于生物信息學，利用Oncomine、GEPIA、cBioPortal等腫瘤數(shù)據(jù)庫綜合分析RASAL2基因在胃癌中的表達、變異及其與預后的關系，并通過體外實驗驗證RASAL2在胃癌細胞增殖、遷移和侵襲中的作用，以期為后續(xù)研究提供線索，也為胃癌的防治提供潛在分子靶標。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌細胞株MGC-803購自中國科學院上海細胞生物學研究所。RPMI 1640培養(yǎng)基、0.25%胰酶、胎牛血清均購自Gibco公司。CCK-8試劑盒購自APExBIO公司。LipofectamineRNAiMAX購自Thermo Fisher Scientific公司。RASAL2-siRNA購自上海拓然生物科技有限公司，序列為：正義鏈5’-GCAAGAUCAUCAACUCUUAdTdT-3’，反義鏈5’-UAAGAGUUGAUGAUCUUGCdTdT-3’，按說明書以50 μL RNAase-free HO/nmolsiRNA溶解為20 μM儲存液，置于-20 ℃凍存待用。RASAL2抗體購自Santa Cruz公司，GAPDH抗體購自Servicebio公司。Transwell小室(24孔)、Matrigel基質(zhì)膠購自SIGMA公司。

1.2 生物信息學分析 使用Oncomine數(shù)據(jù)庫檢索RASAL2在不同組織腫瘤中的基因表達情況。GEPIA數(shù)據(jù)庫驗證RASAL2在胃癌中的表達。通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫進行生存分析，以四分位數(shù)，將患者分為高表達組和低表達組，并按照性別、分化程度及分期進行總生存率及亞組生存分析。通過cBioPortal數(shù)據(jù)庫分析RASAL2在胃癌患者中的變異情況及其與生存預后間的關系。

1.3 細胞培養(yǎng) 胃癌MGC-803細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素、鏈霉素)的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 細胞增殖檢測 取對數(shù)生長期胃癌MGC-803細胞以5×10個/孔接種于96孔板，待細胞融合至60%左右時進行轉(zhuǎn)染。實驗設置陰性對照組與RASAL2沉默組，分別使用與所有基因均無同源性序列的non-target siRNA或RASAL2-siRNA轉(zhuǎn)染MGC-803細胞。以250 μL無血清培養(yǎng)基OptiMEM稀釋5 μL siRNA，250 μL無血清培養(yǎng)基OptiMEM稀釋5 μL Lipofectamine RNA iMAX，混勻室溫孵育5 min；將轉(zhuǎn)染試劑與siRNA稀釋液混合，室溫靜置20 min；將轉(zhuǎn)染復合物按每孔50 μL加入至96孔板中，以無血清培養(yǎng)基RPMI 1640將每孔終體積補至100 μL；轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。設置3個時間點：24 、48 及72小時，于各時間點前2 h加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標儀于450 nm波長下測定各孔吸光度值。

1.5 細胞劃痕實驗 取1×10個胃癌MGC-803細胞接種于6孔板中，待細胞密度達70%～80%進行轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)至細胞長滿單層，用滅菌的10 μL槍頭沿培養(yǎng)板底部劃線，無血清培養(yǎng)基洗去懸浮細胞，用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別在0、24 小時置于倒置顯微鏡下觀察拍照，Image J軟件測量各組劃痕面積，細胞遷移能力以損傷修復百分比表示。

1.6 細胞侵襲實驗 將Matrigel基質(zhì)膠鋪于Transwell小室上室，37 ℃孵育1 h。收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組胃癌MGC-803細胞，以無血清培養(yǎng)基重懸至5×10/mL，接種細胞于Transwell上室，將含10%胎牛血清培養(yǎng)基加入Transwell下室，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出小室。擦除小室表面細胞及基質(zhì)膠，4%多聚甲醛固定10 min，結(jié)晶紫染色后在顯微鏡下拍照計數(shù)，取細胞數(shù)平均值評估細胞侵襲能力。

1.7 Western blot 細胞轉(zhuǎn)染siRNA 24 h后，以RIPA裂解液提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。按每孔20 μg上樣，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗(RASAL2 1∶500，GAPDH 1∶1 000)4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，最后使用ECL化學發(fā)光試劑顯影。

2 結(jié)果

2.1 RASAL2在胃癌組織中表達增加 通過Oncomine數(shù)據(jù)庫共檢索到RASAL2相關的腫瘤研究332項、涉及樣本數(shù)31 947，符合“

P

<0.001；FOLD CHANGE:2；Gene rank: 10%”條件的研究共24項，其中表達增高14項、表達降低10項，見圖1A。在胃癌相關研究中，檢索到的3項研究均表明RASAL2在胃癌組織中的表達高于正常組織，增高倍數(shù)分別為2.638、2.699和3.269，見表1。進一步在GEPIA數(shù)據(jù)庫進行驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在涉及408例胃癌患者與211例對照患者的基因表達數(shù)據(jù)中，RASAL2在胃癌組織中的基因表達水平高于正常組織，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)。見圖1B。

表1 RASAL2在不同胃癌研究中的基因表達差異

圖1 RASAL2在胃癌等常見腫瘤中的表達情況

2.2 RASAL2基因表達與胃癌患者預后分析 RASAL2高表達組總體生存率低于低表達組[風險比(

HR

)=2.28， 95%CI：1.77～2.94，

P

<0.05]，見圖2A。進一步按性別、腫瘤分化程度及分期進行亞組分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在男性與女性胃癌患者中，RASAL2高表達組總體生存率均低于低表達組(男性：

HR

=2.4，

P

<0.05；女性：

HR

=2.73，

P

<0.05)，見圖2B；按分化程度進行分層，RASAL2高表達組與低表達組在高分化和低分化胃癌患者中的總體生存率差異均無統(tǒng)計學意義(

P

>0.05)，但在中分化胃癌患者中，與RASAL2低表達組相比，高表達組總體生存率更低(

HR

=4.74，

P

<0.05)，見圖2C；按分期進行分層，RASAL2高表達組在Ⅰ期和Ⅲ期胃癌患者中的總體生存率均低于RASAL2低表達組，且差異均有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)，其中在Ⅰ期胃癌患者中，RASAL2高表達組相對于低表達組的風險比

HR

高達6.22(

P

<0.05)，但RASAL2高表達與低表達組在Ⅱ期和Ⅳ期胃癌患者中的總體生存率差異無統(tǒng)計學意義(

P

>0.05)。見圖2D。

圖2 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫中RASAL2表達與

2.3 RASAL2在胃癌中的基因變異情況及其與預后的關系 在1 365例胃癌患者中，具有完整的基因突變和拷貝數(shù)變異資料的胃癌樣本共計1 120例，其中78例(變異組)發(fā)生基因變異，其余為非變異組，總變異率為7%，以錯義突變最為常見(28.79%)，見圖3A。進一步對RASAL2基因變異與生存預后進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，變異組與非變異組患者的總體生存率差異無統(tǒng)計學意義(

P

>0.05)，但變異組患者無病生存率更高(

P

<0.05)。見圖3B。

圖3 胃癌患者中RASAL2基因變異情況

2.4 沉默RASAL2對MGC-803細胞增殖的影響 轉(zhuǎn)染siRNA 24 h后收集細胞蛋白進行Western blot檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，轉(zhuǎn)染組細胞RASAL2蛋白表達顯著降低(

P

<0.05)。進一步通過CCK-8檢測細胞活力，結(jié)果表明沉默RASAL2后，細胞增殖速度較對照組顯著下降(

P

<0.05)。見表2。

表2 轉(zhuǎn)染后RASAL2蛋白表達及細胞活力的變化

2.5 沉默RASAL2對MGC-803細胞遷移和侵襲的影響 沉默RASAL2能顯著降低MGC-803細胞遷移和侵襲能力。細胞劃痕實驗顯示，對照組細胞24 h損傷修復面積為(79.57±5.40)%，而RASAL2沉默組為(46.50±2.49)%，兩組差異有統(tǒng)計學意義(

t

=9.632，

P

=0.001)。而在Transwell侵襲實驗中，對照組與RASAL2沉默組平均穿膜細胞數(shù)分別為(188.67±13.58)和(101.33±9.45)，抑制率為53.71%，差異有統(tǒng)計學意義(

t

=9.144，

P

=0.001)。見圖4。

圖4 MGC-803細胞細胞劃痕與Transwell實驗

3 討論

RASAL2是RasGAP基因家族中的一員，廣泛表達于人體各組織器官，其編碼產(chǎn)物為一種Ras-GTP酶激活蛋白，可催化Ras-GTP水解為Ras-GDP，從而發(fā)揮對Ras蛋白活性的負性調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，RASAL2可以通過ERK通路、YAP通路以及調(diào)控外泌體分泌參與胰腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，并且其表達水平與肺癌、肝癌及腎癌患者的生存預后顯著相關，但RASAL2在胃癌患者中的表達及其臨床價值尚無報道。本研究結(jié)果顯示，RASAL2在胃癌患者中的基因表達水平明顯增高，并且其表達水平與胃癌患者生存預后顯著相關。在不同分期胃癌患者中，雖然Ⅱ期和Ⅳ期胃癌患者中RASAL2高表達與低表達組的總體生存率差異無統(tǒng)計學意義，但總體來看RASAL2對分期越早的胃癌患者的生存預測作用越顯著[

HR

：6.22(Ⅰ期)>1.91(Ⅱ期)>1.6(Ⅲ期)>1.12(Ⅳ期)]。表明RASAL2不僅是胃癌患者的生存預測因子，也很可能與胃癌患者的腫瘤進展密切相關。

基因變異包括基因序列變異和基因表達變異，常見變異類型包括錯義突變、移碼突變、插入、缺失等，由此導致基因的結(jié)構(gòu)或表達異常，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RASAL2在胃癌患者中的總體變異率為7%，其中錯義突變最為常見(28.79%)，且RASAL2基因變異組的無病生存率高于非變異組，提示RASAL2基因很可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。

無限增殖和侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學行為，本研究進一步在胃癌細胞株MGC-803中對RASAL2的功能進行研究。結(jié)果表明沉默RASAL2后胃癌MGC-803細胞的增殖速度減慢，并且其遷移和侵襲能力下降，因此，從體外水平驗證了RASAL2在胃癌中的作用及其生物學功能。

綜上所述，本研究通過對腫瘤數(shù)據(jù)庫的信息挖掘與綜合分析揭示了RASAL2基因在胃癌中的表達、變異及其與生存預后的關系，并通過體外實驗驗證了RASAL2在胃癌細胞增殖、遷移和侵襲中的作用，為后續(xù)研究提供了理論及實驗基礎。鑒于本研究僅使用了1種胃癌細胞株(MGC-803)且所用胃癌患者數(shù)據(jù)基于轉(zhuǎn)錄水平，得到的結(jié)論能否推廣到其他胃癌細胞株或胃癌組織尚有待于后續(xù)研究探討。此外，本研究僅初步探討了RASAL2在胃癌中的作用，其具體分子機制亦有待于后續(xù)研究進一步明確。