萬古霉素的塵世之旅

錢璞凡，呂萍

浙江大學(xué)化學(xué)系，杭州310027

“啦啦啦啦，啦啦啦，我是破壞的小行家……”黃色葡萄球菌小黃正在他宿主小高的血漿中邊哼著小曲邊搞破壞，東拆一塊磚，西敲一片瓦，還對周圍環(huán)境中充斥著的青霉素熟視無睹。原來，這個細(xì)菌是一個技藝高超的青霉素耐藥菌，哪怕是青霉素類抗生素中最強(qiáng)勢的對甲氧苯青霉素也拿他束手無策[1]。小黃一路如入無人之境，眼看著就要突入血液-腦脊液屏障[2]，進(jìn)入大腦馳騁了。正當(dāng)小黃神游天外的時候，便迎面撞上了一個分子，莫名的危機(jī)感讓這個小小的細(xì)胞試圖閉上與外界交換物質(zhì)的嘴巴，可還是沒來得及。不過小黃安慰自己，這個分子雖然味道和以前不小心吃到的那些青霉素類抗生素不盡相同[3]，但他可是無所不能的耐藥菌。

可這次他錯了。小黃在血管的轉(zhuǎn)彎處撞了一下血管壁，把細(xì)胞壁上的肽聚糖[4,5]撞落了一些，他這才想起來自己剛剛太貪吃，身子長大了不少，細(xì)胞壁也需要更新一次了。于是他啟動了肽聚糖的合成。可他卻震驚地發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)這一合成過程似乎遇到了一些阻力。仔細(xì)一看，竟是剛剛吃進(jìn)的那個外來的分子，正恰好接到了的肽聚糖鏈一端，導(dǎo)致肽聚糖層間進(jìn)一步的交聯(lián)無法正常進(jìn)行[6]。這可把小黃急壞了：細(xì)胞壁無法更新，他便失去了生長和繁殖的能力，這對于一個單細(xì)胞原核生物而言，意味著生命將在幾個小時的停滯后徹底終結(jié)。他有些不甘心，便調(diào)動了細(xì)胞內(nèi)所有的酶前往肽聚糖合成出錯的位點(diǎn)，試圖將外來的這個奇怪分子解離下來，繼續(xù)合成肽聚糖。可不一會兒，他便頹然地發(fā)現(xiàn)，自己體內(nèi)的酶，似乎都無法識別這個分子，站在這個錯誤跟前束手無策。他絕望了。

沒過幾個小時，小黃在絕望中死去了，就像小高體內(nèi)他那些同樣進(jìn)化出對甲氧苯青霉素耐藥性的同伴們一樣。在瀕死的時刻，小黃依然想不通殺死自己的到底又是何方神圣。其實(shí)消滅他們的，便是多重耐藥革蘭氏陽性菌的天敵，萬古霉素。

1 初次相遇

彼時，東方擬無枝酸菌還只是一種無名放線菌，小東便是出生在加里曼丹島的一個[7]。這天，他和往常一樣，懶洋洋地躺在泥土里感受太陽的溫度。正當(dāng)他快要睡著的時候，突然感覺周圍的泥土開始了快速地上升，嚇得小東趕緊伸出鞭毛，緊緊抓牢邊上的泥土。經(jīng)過一段漫長的下落后，小東突然覺得照在自己身上的光特別冷，隨后便失去了意識。

同小東一樣，彼時的科恩菲爾德也同樣寂寂無名。1953年，從哈佛大學(xué)博士畢業(yè)的他，正帶領(lǐng)著團(tuán)隊(duì)，從各類放線菌的代謝產(chǎn)物中為禮來公司尋找新的抗生素。在顯微鏡下，科恩看到了小東。小東的樣子和從前觀察到的那些放線菌形態(tài)不同，科恩心想，這一定是一個稀有的菌種，一定會有其獨(dú)特功能。想到這，他便頗有干勁地開始從樣本中分離小東。

和往常一樣，科恩分離了土壤樣本中的全部菌種，將他們分開在不同的培養(yǎng)基中，嘗試培養(yǎng)他們的單菌落，進(jìn)而分離他們代謝產(chǎn)生的活性物種。在培養(yǎng)基的滋養(yǎng)下，漂洋過海的小東開始了快速繁殖，成功培育成了一個單菌落，培養(yǎng)基中也出現(xiàn)了一些小東族群的特異代謝產(chǎn)物。經(jīng)過了更加漫長的分離純化過程后，科恩發(fā)現(xiàn)，在體外試驗(yàn)中，這種無名細(xì)菌的培養(yǎng)液中分離得到的一種編號為05865的活性成分，對葡萄球菌有著很強(qiáng)的抑制作用，甚至連對青霉素?zé)o感的金黃色葡萄球菌也有著幾乎相同的殺傷力。隨后他們又進(jìn)行了進(jìn)一步的耐藥性培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)如果在含有活性成分05865的培養(yǎng)基中培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，那怕是經(jīng)過了多次傳代培養(yǎng)，葡萄球菌仍然沒有被誘導(dǎo)出對于活性成分05865的顯著抗藥性[8,9]。

這一發(fā)現(xiàn)讓科恩欣喜若狂。這簡直是撿到寶了啊！近些年來，由于這些耐藥菌的橫行，對于那些青霉素?zé)o法治愈的病人，往往只能乞求奇跡出現(xiàn)，可05865這種活性成分的出現(xiàn)竟然打破了這一點(diǎn)。這簡直是一個發(fā)大財(cái)?shù)暮脵C(jī)會呀！在科恩菲爾德的建議下，禮來公司將這種物質(zhì)命名為萬古霉素(Vancomycin)，取自于英文單詞Vanquish，以彰顯其對革蘭陽性菌的“絕對清除作用”。同時，他們也給漂洋過海的小東起了個名字：東方擬無枝酸菌。自此，默默無名的小東也終于有了他的名字[10]。

現(xiàn)在唯一橫在他們面前的問題就是純度。對于批量生產(chǎn)，禮來公司一點(diǎn)都不擔(dān)心，畢竟只要培養(yǎng)基足夠就行。可東方擬無枝酸菌的代謝產(chǎn)物實(shí)在太多，很多又難以祛除，在沒有全部確定結(jié)構(gòu)之前就貿(mào)然開始臨床試驗(yàn)，萬一這些副產(chǎn)物中，有一些物質(zhì)的毒性很大，那該怎么辦？

這像一桶冷水又澆滅了科恩團(tuán)隊(duì)的喜悅。他們又開始了漫長的嘗試，先是嘗試了用苦味酸進(jìn)行分離，然后在此基礎(chǔ)上對分離方法進(jìn)一步改進(jìn)，但純度一直都卡在80%左右，一直沒能越過85%的大關(guān)。雖然體外實(shí)驗(yàn)都證明了萬古霉素的高效性，但這如果其中的雜質(zhì)對其他器官有害，可不就是對病人不負(fù)責(zé)任？如果確實(shí)能夠找到危重病人，愿意嘗試新藥，那倒也是一大幸事。

2 小試牛刀

凌晨，躺在病床上的愛德華被一陣疼痛疼醒。“哎，嗎啡的效果又過去了，今天又注定是一個不眠夜了。”愛德華望著窗外的明月，心中百感交集。一個月前，因?yàn)槟_部出現(xiàn)了一些小病灶，需要手術(shù)根除，他便住進(jìn)了這家醫(yī)院。手術(shù)非常順利，醫(yī)生說不會有復(fù)發(fā)的風(fēng)險，傷口不發(fā)生感染的話兩周就可以出院。可沒想到命運(yùn)就是捉摸不透，第二天傷口便發(fā)生了細(xì)菌感染，而且在青霉素的作用下也絲毫沒有潰退的趨勢。有次醫(yī)生來查房的時候他問起來，醫(yī)生猶豫半天，才支支吾吾地告訴他，可能是青霉素耐藥菌感染，不過也鼓勵愛德華不要放棄希望，一定是有辦法的。

清晨的陽光從外面灑了進(jìn)來，新的一天又開始了。昨天早上醫(yī)生來查房的時候通知他說，如果感染再擴(kuò)大，細(xì)菌隨時可能進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，感染很快會擴(kuò)散到全身，到時候真地就無力回天了。事到如今，截肢或許是最保險的辦法。醫(yī)生說，現(xiàn)在還沒有對抗耐藥菌的特效藥，或許只能等待奇跡出現(xiàn)。

正在愛德華胡思亂想之際，病房的門被推開了。醫(yī)生快步走進(jìn)來：“愛德華！我的朋友聽說了你的病癥，他告訴我說，禮來公司研發(fā)了一款新藥，對于耐藥菌有奇效，目前已經(jīng)進(jìn)入了II期臨床試驗(yàn)階段。如果你愿意使用的話，我便去問一問，能不能給你申請一點(diǎn)試一試？”

愛德華簡直不敢相信自己的耳朵。好像自己有救了？“好的好的，謝謝醫(yī)生！”

當(dāng)晚，禮來公司的員工便將萬古霉素送了過來，特別囑咐說需要每天給藥兩次，效果才比較好。考慮到愛德華的情況特別危急，醫(yī)生決定每8小時給藥100毫克的劑量[11]，用藥一周。愛德華不會想到，第二天早上，之前青霉素一直無能為力的感染竟好了大半。一個療程還沒結(jié)束，感染便已全部被祛除，可以出院了[12]。

3 當(dāng)頭一棒

就這樣，1958年，由于萬古霉素對于抗耐藥菌感染的奇效，禮來公司在未確定萬古霉素結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上便將其匆匆上市了[13]。剛上市的幾年，萬古霉素確實(shí)因?yàn)槠鋵τ谀颓嗝顾氐母锾m陽性菌都有顯著效果而受到醫(yī)生和病人們的追捧，但隨后幾年中發(fā)生的兩個不大不小的事情，卻迫使人們又重新冷靜了下來。

第一個事情是一個小小的醫(yī)療事故[14]。一家醫(yī)院在治療一位患有化膿性肌炎和骨髓炎的4歲男孩時，在使用萬古霉素進(jìn)行治療時，出現(xiàn)了嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象。由于萬古霉素在此之前也有腎毒性的相關(guān)報(bào)道，因此醫(yī)生選擇了停用萬古霉素，改用了新藥進(jìn)行治療。一停用萬古霉素，男孩持續(xù)的不明原因發(fā)熱隨即消退。而同時期，還有很多有關(guān)萬古霉素腎毒性[15]、耳毒性[16]等副作用的報(bào)道[17]，這使得萬古霉素的安全性受到了一些質(zhì)疑。

第二個事情出乎意料但又在情理之中。耐萬古霉素的細(xì)菌出現(xiàn)了[18]。在長久的臨床治療中，萬古霉素一直被當(dāng)做是感染的最后一道防線。如今，這一道防線竟然破了，那該怎么辦？

這兩個問題鞭策著化學(xué)家們對萬古霉素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行確定，研究其致病機(jī)理，進(jìn)而開發(fā)出更多新藥，才能解決抗藥性這個問題。

4 豁然開朗

時間一晃而過，來到了1980年代。康斯坦斯·哈里斯正端坐在實(shí)驗(yàn)室的電腦前查閱有關(guān)萬古霉素結(jié)構(gòu)確定的文獻(xiàn)。他正在瀏覽謝爾德里克1978年在Nature上發(fā)表的有關(guān)萬古霉素結(jié)構(gòu)鑒定的工作[19]。其實(shí)在之前，對萬古霉素結(jié)構(gòu)的探索，已經(jīng)有了很多階段性的成果。1965年，馬歇爾將萬古霉素降解，嘗試分析降解所得的產(chǎn)物，初步確定了萬古霉素的基本骨架結(jié)構(gòu)，邁出了關(guān)鍵一步[20]。1977年，威廉姆斯和卡爾曼借助核磁共振儀給萬古霉素做了一個全身體檢，在氫核磁共振譜中分別觀察到萬古霉素中6個肽鍵(-CONH-)和1個酰胺鍵(-CONH2)的信號；考慮到肽鏈中氮原子的螯合配位能力，他們分析了不同半徑的Eu3+和Pr3+離子與萬古霉素結(jié)合形成的產(chǎn)物，對于萬古霉素的骨架結(jié)構(gòu)給出了更加具體的指導(dǎo)意見[21]，不過后來他們又對這一結(jié)構(gòu)中芳環(huán)的構(gòu)象進(jìn)行了微小的修正[22]。謝爾德里克則在他們的基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)展，用X射線從不同角度給萬古霉素降解產(chǎn)物CDP-I的單晶照了許多張照片，將各個角度的圖像疊加起來，還原了CDP-I的分子結(jié)構(gòu)，并以此為基礎(chǔ)，結(jié)合其他降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，提出了萬古霉素的結(jié)構(gòu)[19]。

但謝爾德里克的CDP-I的結(jié)構(gòu)中并不含有酰胺鍵(-CONH2)。哈里斯在前期的工作后發(fā)現(xiàn)，似乎有更多證據(jù)支持威廉姆斯含有酰胺鍵(-CONH2)的判斷。他認(rèn)為，基于降解產(chǎn)物CDP-I結(jié)構(gòu)推斷出的萬古霉素異天冬酰胺殘基獨(dú)特結(jié)構(gòu)實(shí)際可能是在萬古霉素降解過程中重排造就的，而這個殘基的前體應(yīng)該就是更常見的天冬酰胺。

但他一直苦于沒能拿到實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

“康斯坦斯，又在想你那個萬古霉素了？”他的同事托馬斯·哈里斯端著杯咖啡走過來問道。

“是啊，還是沒想到該怎么設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)?zāi)玫疥P(guān)鍵證據(jù)。”康斯坦斯顯得有點(diǎn)氣餒。

“你呀，就是又把問題復(fù)雜化了。既然你都有了猜想，那就先把它解決了，再想其他復(fù)雜的事情。先針對你的猜想，去查查有哪些反應(yīng)是天冬酰胺所獨(dú)有的，哪些反應(yīng)是異天冬酰胺殘基獨(dú)有的，要是兩者的反應(yīng)性相互印證，那結(jié)果不就顯而易見了嘛。”

康斯坦斯眼前一亮，當(dāng)即開始設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。首先，相比于僅碳原子端連有基團(tuán)的酰胺鍵(-CONH2)，肽鍵(-CONH-)被碳原子和氮原子伸展出去的兩條鏈固定在中間，具有更大的位阻；倘若使用乙硼烷對這兩種位阻不同的酰胺鍵進(jìn)行還原，由于肽鍵周圍基團(tuán)更豐富，對于外來試劑的排斥更加明顯，導(dǎo)致了乙硼烷靠近時需要克服的阻力和能量要多一些、消耗的時間要長一些，因此肽鍵的還原速度也就慢一些。此外，霍夫曼降解反應(yīng)只有當(dāng)酰胺的氮原子上連有兩個氫原子才能發(fā)生，因此酰胺鍵(-CONH2)可以發(fā)生霍夫曼降解而肽鍵(-CONH-)不能發(fā)生；倘若能觀測到霍夫曼降解的產(chǎn)物，則可以作為分子內(nèi)存在酰胺鍵(-CONH2)更加直接的證據(jù)，更加確鑿地證明萬古霉素中含有天冬酰胺(含1個-CONH2基團(tuán))，而不是像謝爾德里克之前猜測的含有異天冬酰胺殘基(不含-CONH2基團(tuán))[23]。

這兩個實(shí)驗(yàn)都給了康斯坦斯·哈里斯預(yù)想之中的結(jié)果。他的猜想是對的。基于這些事實(shí)，他提出了萬古霉素的結(jié)構(gòu)[24]，如圖1所示。

圖1 萬古霉素的結(jié)構(gòu)

隨著對結(jié)晶條件的進(jìn)一步摸索，人們得到了純度更高的單晶，后續(xù)的X射線衍射實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步驗(yàn)證了康斯坦斯·哈里斯所提出的結(jié)構(gòu)[25,26]。人們同時發(fā)現(xiàn)，萬古霉素中除了氨基酸的碳中心手性之外，將肽鏈交聯(lián)起來的芳環(huán)還存在軸手性和大環(huán)阻轉(zhuǎn)面手性這兩種手性類型[27]，并隨即通過單晶衍射確定了手性軸的絕對構(gòu)型。根據(jù)這一系列結(jié)果，人們建立了萬古霉素的的三維分子模型，完成了從一團(tuán)迷霧，到扁平圖像，再到三維具象的結(jié)構(gòu)建立。自此，萬古霉素終于成了一個有血有肉的分子個體。

而三維結(jié)構(gòu)的建立也使得萬古霉素的殺菌機(jī)理清晰了起來[28]。人們驚奇地發(fā)現(xiàn)，萬古霉素恰好能夠像把“鑰匙”那樣，通過幾對氫鍵[29]，將細(xì)菌細(xì)胞中以L-賴氨酰-D-丙氨酰-D-丙氨酸封端的肽聚糖[30]這把“鎖”緊密地結(jié)合在一起，形成了穩(wěn)定的萬古霉素-肽聚糖復(fù)合物。而當(dāng)“鎖”插入“鑰匙”中后，原先肽聚糖“鎖”與“鎖”之間的進(jìn)一步交聯(lián)被抑制了，讓細(xì)菌失去了合成細(xì)胞壁的能力。為了驗(yàn)證這個作用模型，研究萬古霉素的專家威廉姆斯和他的同事一起，在核磁共振氫譜上找到了將“鎖”和“鑰匙”拉在一起的氫鍵[31,32]；后來謝弗等人[33]又拿出給分子照相的看家本領(lǐng)，用X射線拍到了連接著萬古霉素和肽聚糖的氫原子。

5 化身千百

“小萬，小萬，快醒醒，你又多了一個弟弟！”自從結(jié)構(gòu)確定、滅菌作用模型確定以來，萬古霉素和他們家族的分子都好像憑空有了靈魂，針對前一代藥物暴露出的耐藥性、作用模式、副作用等弊端，涌現(xiàn)出一批以小萬為骨架的新成員[34]。只不過因?yàn)槟腿f古霉素細(xì)菌的緩慢增加，小萬在臨床一線拋頭露面的機(jī)會少了些，也就常常無所事事，陷入沉睡。

這會兒，小萬的家族又壯大了，兄弟姐們正在叫他起床呢。小萬睜開眼一看，圍在他周圍的除了替考拉寧、達(dá)巴萬星、奧利萬星之外，又多了一個陌生面孔。他們告訴小萬，這個新成員叫做特拉萬星，他除了能夠與肽聚糖前體的末端結(jié)合之外，同時還能改變細(xì)胞膜的通透性，兩大效應(yīng)協(xié)同作用，殺死革蘭氏陽性菌[35]。

小萬有些驚訝。這些年里，他每一次醒來，看到的新成員都會讓他感慨藥物發(fā)展的速度之快。不知道下一次醒來，身邊又會多出哪個小伙伴呢？

“大概還會有效果更強(qiáng)、毒副作用更弱的的弟弟妹妹吧。”想著想著，小萬又睡了過去……