黃芪甲苷對局灶節段性腎小球硬化小鼠尿蛋白的影響*

于曉霞，吳 華，邊 艷，鄭明楠，樸明姬，朱 虹，高弼虎

(大連大學附屬中山醫院腎內科，遼寧大連 116001)

局灶節段性腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis,FSGS)是全球范圍內終末期腎臟病的重要病因之一[1]。病理主要表現為局灶、節段腎小球硬化及小管間質纖維化，以蛋白尿或腎病綜合征為主要特征。FSGS為難治性腎病綜合征的主要病理類型，對激素治療不敏感，預后不佳，多數患者5～10年后進展為終末期腎臟病[2]，因此，迫切需要有效的治療手段。

黃芪是我國傳統中藥，具有補益脾腎、益氣升陽、行氣利水等功效，已被廣泛用于治療慢性腎臟病。黃芪甲苷是黃芪的主要藥理活性成分之一，具有抗炎、抗免疫、抗凝等作用[3-4]。近年來有研究發現，黃芪甲苷能從多種途徑減少足細胞損傷，發揮腎臟保護作用[5-6]。因此，本研究通過眼球后注射阿霉素建立FSGS小鼠模型，通過觀察黃芪甲苷對其尿蛋白的影響，初步探討了黃芪甲苷對FSGS小鼠的保護作用，旨在為其進一步臨床應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

健康SPF級雄性BALB/c小鼠30只，體重(20.62±2.41)g，由遼寧長生生物技術有限公司提供[實驗動物生產許可證號：SCXK(遼)2020-0001]。在大連大學附屬中山醫院動物實驗中心飼養[實驗動物使用許可證號：SYXK(遼)2018-0005]。采用抽簽法分為對照組、模型組和黃芪甲苷組，每組10只。實驗過程嚴格按大連大學附屬中山醫院動物實驗倫理委員會的條例執行。

1.2 藥物及試劑

阿霉素注射粉劑購自北京索萊寶科技有限公司(批號：D8740)，異氟烷購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(批號：B2028066)，戊巴比妥那購自美國Sigma公司(批號：P3761)，尿清蛋白/肌酐(albumin to creatinine,ACR)檢測試劑盒購自南京建成有限公司(批號：20190722)。

1.3 儀器

全自動生化分析儀(日本Olympus公司 AUA640)、光學顯微鏡(日本Olympus公司 CX41)、切片機(德國徠卡公司 UC7)、低溫離心機(德國Sigma公司 8K)等。

1.4 方法

1.4.1模型制備及給藥

(1)FSGS模型組：經眼球后注射阿霉素(10 mg/kg)建立實驗FSGS小鼠模型。術前及注射阿霉素后第1周(實驗第1周)開始留取尿液，模型組小鼠ACR與正常組比較，差異有統計學意義(P<0.05)為造模成功。(2)對照組：眼球后注射與阿霉素同等劑量生理鹽水。(3)黃芪甲苷組：造模方法同模型組相同。參照文獻[7]報道的劑量，實驗第2周開始每天給予黃芪甲苷40 mg·kg-1·d-1(用1%羧甲基纖維素鈉溶解)灌胃，共8周。對照組及FSGS模型組均給予含1%羧甲基纖維素鈉的生理鹽水灌胃。

1.4.2ACR檢測

造模前，實驗第1、10周末分別收集各組小鼠尿液，低速低溫離心，去除沉渣，按試劑盒說明書采用酶聯免疫吸附測定法測定小鼠尿清蛋白和肌酐，計算ACR。

1.4.3生化指標檢測

第10周末用3%戊巴比妥那麻醉各組小鼠后心臟穿刺采血，血液標本置于含抗凝劑乙二胺四乙酸的離心管中，離心取上清液置于-20 ℃冰箱保存，使用全自動生化分析儀測定總膽固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density liptein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density liptein cholesterol,HDL-C)等。使用全自動血凝分析儀檢測凝血酶原時間(prothrombin,PT)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)、纖維蛋白原(fibrinogen,Fg)等。

1.4.4腎臟取材及病理學檢查

10周末將各組小鼠麻醉后處死，取左側腎臟用磷酸鹽緩沖溶液沖洗后去除包膜，左腎經4%多聚甲醛固定24 h，75%～100%乙醇逐步脫水，浸蠟，石蠟包埋，連續切片(厚度2 μm)，行過碘酸雪夫反應染色(PAS)，光鏡觀察腎組織形態學改變。

1.4.5計算腎小球硬化指數(GSI)

取各組小鼠包埋好的腎臟石蠟標本進行連續切片(厚度2 μm)，行蘇木精-伊紅染色，并應用半定量法評估腎小球硬化程度[8]。腎小球硬化的定義為腎小球毛細血管腔塌陷和(或)玻璃樣變性，每張切片觀察大于或等于30個腎小球，依據腎小球硬化面積占腎小球比例分為0～4級：(1)0級為腎小球基本正常；(2)1級為腎小球硬化面積小于25%；(3)2級為腎小球硬化面積占25%～<50%；(4)3級為腎小球硬化面積占50%～75%；(5)4級為腎小球硬化面積大于75%。GSI=[(1N1+2N2+3N3+4N4)/每張切片腎小球總數]×100%，N1、N2、N3、N4分別為1、2、3、4級腎小球硬化個數。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 生存情況

對照組小鼠在實驗中未出現死亡；模型組小鼠于注射阿霉素后第2天死亡1只，第5周死亡1只；黃芪甲苷組小鼠于實驗第3周死亡1只。

2.2 ACR變化

各組小鼠造模前ACR比較，差異無統計學意義(P>0.05)；模型組和黃芪甲苷組小鼠造模后第1周末ACR均較對照組明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，提示造模成功。與對照組比較，模型組小鼠第10周末ACR明顯增加，黃芪甲苷治療后小鼠ACR水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較。

2.3 3組小鼠血脂水平比較

與對照組比較，模型組小鼠第10周末TC、TG、LDL-C水平均明顯增加，HDL-C 水平下降，差異均有統計學意義(P<0.05)；黃芪甲苷組小鼠TC、TG、LDL-C水平均較模型組明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，HDL-C水平略升高，但差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組小鼠血脂水平比較

2.4 3組小鼠凝血功能比較

與對照組比較，模型組小鼠第10周末PT、APTT明顯縮短，Fg明顯增加，差異均有統計學意義(P<0.05)；黃芪甲苷組小鼠Fg較對照組略升高，但差異無統計學意義(P>0.05)。與模型組比較，黃芪甲苷組小鼠PT、APTT明顯延長，Fg明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組小鼠凝血功能比較

2.5 腎臟組織形態學觀察

對照組小鼠腎小球偶見局灶、節段性腎小球系膜細胞及系膜基質增生，偶見腎小球局灶、節段性硬化，小管間質未見明顯異常。模型組小鼠可見彌漫腎小球系膜細胞及系膜基質增多，多個腎小球局灶、節段性硬化，腎間質可見灶狀單個核細胞浸潤，腎小管上皮細胞空泡變性，部分腎小管上皮細胞脫落。黃芪甲苷組小鼠腎小球見輕度系膜細胞及系膜基質增生，部分腎小球可見局灶、節段性硬化，腎小管及腎間質未見明顯病理改變，見圖2。

2.6 3組小鼠GSI比較

對照組小鼠腎小球毛細血管袢開放良好，每個系膜區不超過3個系膜細胞，偶見腎小球硬化。與對照組比較，模型組小鼠腎小球硬化數量明顯升高，GSI明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)；黃芪甲苷組小鼠可見部分腎小球硬化，GSI較模型組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

A：對照組；B：模型組；C：黃芪甲苷組。

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較。

3 討 論

FSGS是難治性腎病綜合征和終末期腎病的常見原因。目前，原發性FSGS雖然有大量的治療手段，如糖皮質激素、免疫抑制劑、血管緊張素轉換酶抑制劑/受體拮抗劑等，但很多患者對糖皮質激素及免疫抑制劑治療反應不佳，導致疾病進展出現腎小球硬化和腎間質纖維化，最終發展至ESRD，嚴重影響患者的生活質量[9-10]。近年來，隨著中醫藥的優勢逐漸被重視，中西醫結合治療腎小球疾病已在臨床廣泛應用。中醫認為，FSGS屬本虛標實，腎虛為主，常將其歸屬于“腎風”“尿血”等范疇[11]。呂靜等[12]認為，FSGS病變初期病機為腎絡虛滯，病變后期病機轉為腎絡瘀阻，治療方面應以益氣化瘀療法為治則。作為補氣中藥的代表，黃芪性甘，微溫，歸脾、肺經，具有補氣健脾、升陽舉陷、益胃固表、利尿消腫、托毒生肌等功效，已被廣泛用于治療各類腎臟疾病[12-13]。黃芪甲苷作為黃芪的主要活性成分，其藥效也被大量的臨床觀察所證實，因此，本研究觀察了黃芪甲苷對FSGS模型小鼠尿蛋白等指標的影響。

本研究采用注射阿霉素的方法建立FSGS小鼠模型，也是目前常用的模擬人類FSGS的動物模型。阿霉素是一種強效的細胞毒類抗腫瘤藥，可同時抑制細胞DNA、RNA合成，誘導細胞凋亡，對腎小球臟層上皮細胞、毛細血管內皮細胞、腎小管上皮細胞均具有明顯毒性損傷，最終導致FSGS。本研究給予阿霉素球后靜脈注射后模型組小鼠病理學檢查可見多個腎小球局灶節段性硬化，支持造模成功。

FSGS的主要臨床特征為大量蛋白尿。蛋白尿既是慢性腎臟病的始動因素又是慢性腎臟病的加重因素，因此，積極防治蛋白尿一直是FSGS研究的重點。目前認為，24 h尿蛋白定量或過夜時段尿清蛋白排泄率是診斷蛋白尿的金標準，但上述2種檢查不僅耗時耗力，而且尿液留取及測量的準確性較難保障。ACR是分別檢測尿液中微量清蛋白和肌酐含量，計算二者比值來反映清蛋白的排泄情況，ACR具有很好的穩定性，檢測結果與尿清蛋白排泄率具有一致性，而且留取方便，是一項簡單、快捷、準確反映尿微量清蛋白排泄的指標[14]。本研究結果顯示，模型組小鼠ACR水平較對照組明顯升高，應用黃芪甲苷治療后ACR水平明顯下降，腎臟的病理損傷程度及GSI均明顯降低。表明黃芪甲苷治療具有降低FSGS小鼠尿蛋白，并減輕腎臟病理損傷的作用，與HE等[15]研究結果一致。

1982年MOORHEAD等[16]首次提出，高脂血癥是腎小球硬化發生、發展的獨立致病因素。低密度脂蛋白升高是高脂血癥的重要表現，而在體內氧化低密度脂蛋白是低密度脂蛋白的氧化修飾形式，氧化低密度脂蛋白可通過引起脂質積累、炎性反應等直接或間接損傷足細胞，導致FSGS的發生。本研究也發現，模型組小鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C水平均明顯高于對照組，而黃芪甲苷治療可一定程度降低FSGS小鼠的血脂水平。

凝血是機體重要的生理過程，目前，大量臨床資料已證實，凝血與纖溶功能平衡紊亂是腎小球硬化及間質纖維化病變發展過程中的重要病理生理改變。PT、APTT分別反映外源性凝血系統和內源性凝血系統功能狀況，Fg是血漿中含量最高的凝血因子，其水平增高提示血液處于高凝狀態。本研究結果顯示，模型組小鼠PT、APTT明顯縮短而Fg明顯升高，提示FSGS小鼠血液處于高凝狀態，黃芪甲苷可延長FSGS小鼠PT及APTT，降低Fg，改善模型小鼠的高凝狀態。

綜上所述，黃芪甲苷可降低FSGS小鼠尿蛋白水平，減輕腎臟病理損傷，降低其血脂水平，同時還能改善模型小鼠的高凝狀態，為黃芪甲苷進一步在臨床合理應用提供了實驗依據。