達(dá)格列凈促進(jìn)小鼠骨骼肌細(xì)胞系C2C12分化的作用及機(jī)制的研究*

何廉旗,任智超,徐 丹，張翠麗，宋占春△

(1.遼寧省撫順市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科 113006；2.遼寧省撫順市中心醫(yī)院科教部 113006；3.大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧大連 116044)

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病。而骨骼肌占人體重量的40%，是人體最大的代謝器官，因此，骨骼肌功能完整對(duì)維持機(jī)體代謝穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[1]。骨骼肌的肌纖維表面的衛(wèi)星細(xì)胞是一種干細(xì)胞，當(dāng)骨骼肌受到損傷(包括運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的牽拉傷、物理創(chuàng)傷、化學(xué)損傷等)時(shí)，靜止的衛(wèi)星細(xì)胞被激活，進(jìn)行增殖、分化、融合，最終生長(zhǎng)為成熟肌纖維，完成對(duì)受損骨骼肌的修復(fù)[2]。有研究表明，糖尿病患者骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化能力明顯降低，導(dǎo)致骨骼肌再生能力下降[3-4]。

新型口服降糖藥——達(dá)格列凈(dapagliflozin,DAPA)通過抑制鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2活性，促進(jìn)尿糖排泄，降低血糖水平[5]。有研究表明，DAPA對(duì)腺苷酸活化蛋白激酶(adenylate-activated protein kinase,AMPK)具有激活作用[6-7]。而AMPK是骨骼肌細(xì)胞分化的重要的調(diào)控因子，可通過激活一系列下游分子促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞分化[8-9]。盡管如此，DAPA在骨骼肌細(xì)胞分化中的作用尚少見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用小鼠成肌細(xì)胞系C2C12細(xì)胞作為研究對(duì)象，擬明確DAPA在C2C12細(xì)胞分化中的作用，并初步闡明其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠成肌細(xì)胞系C2C12細(xì)胞購自美國(guó)ATCC公司，DAPA購自美國(guó)MCE公司，胎牛血清及馬血清均購自美國(guó)Gibco公司，AMPK抑制劑Compound C(CC)、小鼠抗生肌素(myogenin)抗體(ab1835)及小鼠抗肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain,MyHC)抗體(ab51263)均購自美國(guó)Abcam公司，肌酸激酶(creatine kinase,CK)活性測(cè)定試劑盒及小鼠抗β-tubulin(SAB4200732)抗體均購自美國(guó)Sigma公司，小鼠抗生肌決定因子1(myogenic determination factor 1，MyoD)抗體(sc_32758)購自美國(guó)Santa Cruz公司，兔抗AMPKα抗體(2532s)及兔抗p-AMPK抗體(2537s)均購自美國(guó)CST公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

將C2C12細(xì)胞接種于100 mm培養(yǎng)皿中，使用含10%胎牛血清杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)培養(yǎng)基(生長(zhǎng)培養(yǎng)基)，于37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%融合時(shí)按1∶3進(jìn)行細(xì)胞傳代。傳代細(xì)胞仍按上述培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.2細(xì)胞分化體系的建立及形態(tài)學(xué)觀察

在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中待C2C12細(xì)胞融合至80%左右時(shí)將培養(yǎng)基更換為含2%馬血清的DMEM培養(yǎng)基(分化培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)，每隔1 d換液1次，誘導(dǎo)分化7 d，使用相差顯微鏡觀察分化后肌管形態(tài)并采集圖像，計(jì)算細(xì)胞分化指數(shù)(融合2個(gè)或2個(gè)以上細(xì)胞核的細(xì)胞的百分比)。藥物干預(yù)即在基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入不同濃度DAPA(終濃度為0、5、10、50 μmol/L)及CC(終濃度為10 μmol/L)。

1.2.3CK活性測(cè)定

1.2.4Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

收集1.2.2項(xiàng)各組細(xì)胞，加入蛋白裂解液于冰上放置30 min，4 ℃、10 000 g離心10 min，上清液為細(xì)胞總蛋白。采用蛋白定量(BCA)法測(cè)定蛋白濃度。50 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺電泳。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜后于5%脫脂牛奶中封閉1 h。加入一抗(稀釋比均為1∶1 000)，4 ℃封閉過夜。次日，二抗(稀釋比均為1∶5 000)孵育45 min后進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色。采用ImageJ 1.51軟件對(duì)Western blot帶進(jìn)行灰度分析。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)

收集1.2.2項(xiàng)各組細(xì)胞，使用北京普洛麥格公司RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，并測(cè)定其濃度及純度。使用日本TAKARA公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取細(xì)胞cDNA。從NCBI網(wǎng)站下載小鼠MyoD、Myogenin、MyHC及GAPDH基因DNA及mRNA序列。采用primer 3.0軟件設(shè)計(jì)引物，MyoD-正向:CAAGACCACCAACGCTGATC,MyoD-反向:CAGACCTTCGATGTAGCGGA;Myogenin-正向:ATCTGCACTCCCTTACGTCC,Myogenin-反向:GACAGCCCCACTTAAAAGCC;MyHC-正向:AGCTTGAAAACGAGGTGGAA,MyHC-反向:CCTCCTCAGCCTGTCTCTTG;GAPDH-正向:AGTGTTTCCTCGTCCCGTAG,GAPDH-反向:GCCGTGAGTGGAGTCATACT。采用實(shí)時(shí)熒光定量法測(cè)定上述基因循環(huán)數(shù)(cycle threshold，Ct)值，反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，共40個(gè)循環(huán)。通過2-ΔΔCT計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 DAPA促進(jìn)C2C12細(xì)胞分化

DAPA以濃度依賴方式促進(jìn)C2C12細(xì)胞分化，同時(shí)，細(xì)胞CK活性增加，見圖1。DAPA 50 μmol/L組C2C12細(xì)胞分化指數(shù)、CK活性與DAPA 10 μmol/L組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，故選用DAPA濃度為10 μmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 DAPA在mRNA水平及蛋白水平上調(diào)C2C12細(xì)胞MyoD、Myogenin、MyHC的表達(dá)

DAPA上調(diào)C2C12細(xì)胞MyoD、Myogenin、MyHC的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.3 DAPA通過上調(diào)AMPK磷酸化水平促進(jìn)C2C12細(xì)胞分化。

與DAPA組細(xì)胞分化程度比較，DAPA+CC組分化明顯減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖3 A、B。與對(duì)照組比較，DAPA組AMPK磷酸化水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；DAPA+CC組AMPK磷酸化水平及MyHC表達(dá)水平均明顯低于DAPA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3 C、D。

A：相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)(比例尺=20 μm)；B：分化指數(shù)柱狀圖；C：CK活性測(cè)定；a：P<0.05，與DAPA 0 μmol/L組比較。

A：實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析mRNA表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參；B：Western blot分析蛋白表達(dá)水平；C：灰度分析柱狀圖；對(duì)照組：未給予DAPA分化7 d的C2C12細(xì)胞。

A：相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)(比例尺=20 μm)；B：分化指數(shù)柱狀圖；C：Western blot分析蛋白表達(dá)水平；D：灰度分析柱狀圖；對(duì)照組：未給予DAPA分化7 d的C2C12細(xì)胞。

3 討 論

隨著生活方式的改變，肥胖及其相關(guān)代謝綜合征的發(fā)生日趨普遍。骨骼肌是全身最大的代謝器官，對(duì)維持機(jī)體代謝穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要作用。骨骼肌再生是保護(hù)骨骼肌結(jié)構(gòu)及功能完整的關(guān)鍵。骨骼肌再生分為4個(gè)階段，包括衛(wèi)星細(xì)胞增殖、分化、融合及生長(zhǎng)。有研究表明，肥胖導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞分化障礙[10]。而在諸多調(diào)控衛(wèi)星細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子及信號(hào)分子中生肌調(diào)控因子(包括生肌因子5、MyoD、Myogenin和生肌調(diào)節(jié)因子4)最為重要[11]。首先，生肌因子5在衛(wèi)星細(xì)胞分化初始階段表達(dá)持續(xù)增加，隨之激活其他生肌調(diào)控因子。隨著MyoD高表達(dá)，衛(wèi)星細(xì)胞正式進(jìn)入分化階段。MyoD、Myogenin相互交叉激活，與啟動(dòng)子或增強(qiáng)子區(qū)域的E-box元件結(jié)合，誘導(dǎo)一系列生肌相關(guān)基因的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)MyoD或Myogenin會(huì)直接抑制骨骼肌細(xì)胞分化[12]。因此，MyoD、Myogenin在調(diào)節(jié)骨骼肌細(xì)胞分化中至關(guān)重要。

新型口服降糖藥DAPA因具有獨(dú)立于降糖作用以外的諸多優(yōu)勢(shì)備受關(guān)注。有研究表明，DAPA具有明顯抗炎作用，對(duì)諸多臟器具有保護(hù)作用，如心臟、肝臟、腎臟及腦[13-16]。本研究采用DAPA作用于C2C12細(xì)胞，誘導(dǎo)分化，通過相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，DAPA可促進(jìn)C2C12細(xì)胞分化。同時(shí)，DAPA使C2C12細(xì)胞中生肌調(diào)控因子MyoD、Myogenin及衛(wèi)星細(xì)胞分化標(biāo)志物MyHC表達(dá)增加，肌管特異性標(biāo)志物CK活性增加。

有研究表明，肥胖抑制AMPK磷酸化，導(dǎo)致骨骼肌再生障礙[17]。而AMPK磷酸化是骨骼肌細(xì)胞分化的重要調(diào)控因子[18-19]。有研究表明，DAPA在許多組織中可促進(jìn)AMPK磷酸化[7,20-21]。本研究結(jié)果顯示，DAPA作用于C2C12細(xì)胞后AMPK磷酸化明顯增加。而在加入CC干預(yù)后通過相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，DAPA促進(jìn)C2C12細(xì)胞分化的作用消失，MyHC表達(dá)明顯減低，說明DAPA通過增加AMPK磷酸化促進(jìn)C2C12細(xì)胞分化。

綜上所述，DAPA在小鼠成肌細(xì)胞系C2C12細(xì)胞中促進(jìn)AMPK磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)C2C12細(xì)胞分化。盡管如此，但DAPA在小鼠骨骼肌再生中的作用仍需進(jìn)一步探究。本研究證實(shí)了DAPA在骨骼肌損傷后再生中可能存在潛在的價(jià)值，為臨床肌病的治療提供了新的思路。