一株根霉菌在提高米醋風味方面的應用

黃艷，周其洋，高庭，童星,2*

(1.佛山市海天(高明)調味食品有限公司，廣東 佛山 528511；2.佛山市海天調味食品股份有限公司，廣東 佛山 528000)

米醋是以大米為原料，經過液化、糖化、酒精發酵、醋酸發酵等工藝制備而成的調味品。含有豐富的氨基酸、有機酸、維生素及礦物質，營養豐富。米醋品質的好壞，除與醋酸菌有關外，還與米酒息息相關，原料大米的液化、糖化及酒精發酵是提升米酒及米醋品質的關鍵。好曲出好酒，通過提升微生物的糖化力、液化力及產酒、產酸性能，選育不同類型的微生物，如醋酸菌等的選育或者固定化[1-3]，高產糖化酶的米根霉、酵母選育[4-5]，進行相應的工藝優化，均在米酒品質提升上取得了不錯的進展。隨著技術的進步，酶在調味品中廣泛應用[6]，2種微生物的協同制曲已在醬油中應用，4種酶活力都不同程度地提高[7]，為米曲微生物共發酵帶來了新的思考。本文通過對傳統酒曲的篩選，獲得一株高糖化酶、高產酸性蛋白酶，不產黑孢子的根霉菌。采用該菌株與增香產酯酵母共同培養制備米曲，發酵米酒，再經醋酸菌作用獲得米醋，可顯著改善液態發酵食醋的口感與風味，提升米醋的品質。

1 材料與方法

1.1 材料

原材料：以佛山市海天調味食品有限公司生產的酒曲作為菌種篩選原材料。

培養基的制備方法：初篩培養基的制備方法：稱取200 g馬鈴薯，洗凈、去皮、切碎，加水1000 mL煮沸0.5 h，用紗布過濾，再加10～20 g葡萄糖和15～20 g瓊脂，充分溶解，分裝，高壓蒸汽滅菌(121 ℃，20 min)。復篩培養基的制備方法：牛肉膏 5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉 5 g，可溶性淀粉2 g，水1000 mL，pH 7.0～7.2，瓊脂20 g，高壓蒸汽滅菌(121 ℃，20 min)。

1.2 菌種的選育與鑒定方法

1.2.1 初篩方法

在滅菌后的超凈臺內，將酒曲粉碎后，過40目篩，稱取篩下物25 g加入裝有225 mL無菌三級水的三角瓶中，加入數顆玻璃珠，于150 r/min搖床中振蕩30 min，使得酒曲的微生物均勻分布形成菌懸液。

將所得到的菌懸液進行梯度稀釋，添加無菌水制成不同的稀釋梯度10-3，10-4，10-5，10-6CFU/mL的稀釋液，吸取0.2 mL加入含有去氧膽酸鈉和鏈霉素的PDA固體培養基，用涂布棒涂布均勻。

將上述平板置于30 ℃培養箱培養24 h后，挑選具有根霉菌典型菌落形態的單菌落，挑種至PDA培養基再培養，進而純化出根霉純菌。

1.2.2 復篩方法

將上述純化的單菌落轉接到淀粉鑒別培養基中進行培養，以水解圈大小對各菌落進行編號，培養一段時間后，挑選水解圈/菌落圈最大的菌株。

將挑選后的菌株經過多次初篩、復篩后，最終篩選出一株根霉菌，命名為ZH805。

1.2.3 菌種鑒定

采用常規微生物鑒定方法。

1.3 協同制備種曲的方法

1.3.1 小斜面培養

將選育的根霉菌接種于PDA固體培養基中，增香產酯酵母接種于麥芽汁固體培養基(制備方法：1000 mL麥芽汁，15～20 g瓊脂，高壓蒸汽滅菌(115 ℃，20 min)中，分別于30 ℃培養2～3 d，即活化為一代菌株。

1.3.2 三角瓶培養

將1.3.1步驟的選育根霉菌接種于已滅菌的PDA液體培養基(制備方法：稱取200 g馬鈴薯，洗凈、去皮、切碎，加水1000 mL煮沸30 min，用紗布過濾，再加10～20 g葡萄糖，充分溶解后趁熱用紗布過濾，分裝，高壓蒸汽滅菌(121 ℃，20 min)，于30 ℃，150 r/min培養24 h，使其菌體濃度為107～108CFU/mL，于4 ℃冰箱中保藏備用。

將1.3.1步驟的增香產酯酵母接種于已滅菌的PDA液體培養基中，于30 ℃,150 r/min培養24 h，使其菌體濃度為107～108CFU/mL，于4 ℃冰箱中保藏備用。

1.3.3 種曲培養

將麩皮與米糠按照7∶3(質量比)進行混合、潤水，裝于曲盤中，每盤裝5 kg曲料并進行滅菌，然后將1.3.2步驟的選育根霉菌和增香產酯酵母分別接種于已事先滅菌的曲料中，于30 ℃條件下進行擴大培養，培養2～3 d即可成熟，為種曲。

1.4 成曲及米酒制備方法

大米→洗凈→浸泡→蒸飯→淋冷→拌曲→糖化發酵→過濾處理→巴氏滅菌→成品米酒。

以大米為原料，加入自來水浸泡6～8 h，濾干水后，于0.15 MPa壓力下蒸煮30 min，待米飯冷卻后分別添加上述種曲，選育根霉菌接種量為1%，產酯酵母接種量為6‰～8‰，同時以根霉菌3.866、根霉菌Q303為對照，于30 ℃、相對濕度80%左右條件下培養48～72 h，培養結束即為成熟曲料，取成熟曲料檢測糖化酶、酸性蛋白酶和酯化酶活力。

將曲料加水，接入已活化好的活性干酵母，接種量為5%，接種后將曲料攪拌均勻。于28～33 ℃條件下靜置發酵4～5 d，發酵結束后通過板框過濾器進行壓榨，得到米酒清液，并檢測米酒清液的酒精度。

1.5 發酵米醋制備方法

將上述米酒清液泵送至醋酸發酵罐，接入已活化好的醋酸菌進行醋酸發酵，采用Frings深層液態發酵罐(德國福林斯公司)，獲得對應米醋醋坯。

1.6 檢測方法

1.6.1 糖化酶活力、酯化酶活力的測定

參照國標GB 1886.174-2016《食品添加劑 食品工業用酶制劑》中的方法。

1.6.2 酸性蛋白酶活力的測定

參照國標GB/T 23527-2009《蛋白酶制劑》。

1.6.3 酒精度的測定

采用蒸餾-重鉻酸鉀比色法測定[8]。

1.6.4 還原糖的測定

采用國標GB/T 5009.7-2016《食品中還原糖的測定》[9]。

1.6.5 總酸、氨基酸態氮的測定

參照國標GB/T 13662-2008《黃酒》中的方法[10]。

1.6.6 總酯的測定

參考GB/T 19777-2013《地理標志產品 山西老陳醋》[11]。

1.6.7 不揮發酸的測定

采用酸堿中和滴定法。

2 實驗結果

2.1 菌種的選育及鑒定

將篩選出的選育根霉菌進行相關的生理生化特性檢測，其檢測結果與根霉菌3.866對比，基本一致。

依據1973年科學出版社出版的周德慶主編的《微生物學實驗手冊》、《常見與常用真菌》相關書籍作為菌株形態學特征的參考依據。

本文篩選的選育根霉菌的菌落形態為PDA固體培養基培養15 h后，菌落直徑約為1.0～1.4 cm，菌絲致密。36 h后菌絲鋪滿整個平板，該平板的形態見圖1。

圖1 根霉ZH805菌落形態圖Fig.1 The colony morphology of Rhizopus ZH805

由圖1可知，選育根霉菌均為白色孢子，無黑色孢子產生。

2.2 不同根霉菌制備成曲及發酵米酒關鍵指標的檢測結果

對不同根霉制備的成熟曲料檢測糖化酶、酸性蛋白酶和酯化酶活力，對應曲料發酵成熟后，檢測米醋的酒精度和還原糖指標，其檢測結果見表1。

表1 不同根霉菌制備曲料及發酵米酒檢測結果Table 1 The testing results of koji materials prepared by different Rhizopus and fermented rice wine

由表1可知，采用選育根霉菌制備的米曲檢測糖化酶、酸性蛋白酶和酯化酶較根霉菌3.866分別提高了58%、43%、37.5%，較根霉菌Q303分別提高了17.4%、35%、31%。采用選育根霉菌發酵的米酒，其酒精度較根霉3.866和根霉Q303分別提高了24.4%和12%，且其清液殘留的還原糖也明顯高于其他兩株根霉，充分說明根霉ZH805較其他兩株根霉具有較高的原料利用率。

2.3 米醋關鍵理化指標和感官鑒評結果

表2 不同曲料發酵米醋檢測結果Table 2 The testing results of fermented rice vinegar with different koji materials

由表2可知，對比現有工藝生產米醋與選育根霉菌制備的米醋，選育根霉菌的各項理化指標均要遠遠優于常規的液態發酵米醋，特別是其氨基酸態氮、總酯與不揮發酸方面。對比不同根霉菌制備的米醋，選育根霉菌在酸度相近的情況下，其他各項理化指標均優于另外兩組根霉發酵的米醋。

將現有工藝生產的米醋、選育根霉菌與根霉菌3.866、根霉菌Q303發酵的米醋在色澤、香氣、刺激性、回甜度、酸味等方面進行感官鑒評分析，感官鑒評由經過專業訓練的專業人員進行，以上評價指標的分值為0～5分，分數越高，該項指標越好，其鑒評結果見表3和圖2。

表3 米醋感官鑒評結果Table 3 The sensory evaluation results of rice vinegar

圖2 發酵米醋感官鑒評結果Fig.2 The sensory evaluation results of fermented rice vinegar

由表3和圖2可知，與原工藝生產的米醋相比，根霉菌大米制曲發酵的米醋在香氣、色澤、回甜度等方面均有較大改善，且選育根霉菌在香氣、色澤和回甜度3個維度上的表現均要優于其他兩株根霉菌。綜上所述，采用選育根霉菌米曲制備工藝可以顯著改善液態發酵食醋的口感與風味，全面提升米醋的質量。

3 結論

本文通過從米曲中篩選優勢根霉菌，結合我司優秀的產酯酵母共同制曲后，進行米酒發酵，進而借助醋酸菌制備米醋。不同于同行業以往的思路，進行單一優勢菌種的選育，本文中選育的根霉來源于酒曲，增香酵母為我司自有優勢酵母，借助這種優勢微生物互補作用，首先增大工業化大生產下米酒工藝的穩定性，進而更加穩定地提升米醋的品質。