正交法優(yōu)化超聲波輔助棗皮紅色素提取工藝研究

王釗，李長濱，李玉江，許俊亞，李青靜，張本尚，鄒建*

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院 食品與生物工程學院，鄭州 450046；2.河南省科學院高新技術(shù)研究中心，鄭州 450002)

長期以來，合成色素被大量用于食品生產(chǎn)，雖然合成色素廉價易得、性質(zhì)穩(wěn)定、色彩艷麗[1]，但其本身具有潛在的安全隱患，在人體內(nèi)可代謝生成致癌物[2]，因此，對天然色素的開發(fā)成為人們關(guān)注的焦點。近年來，人們陸續(xù)研究開發(fā)了多種天然紅色素，不但色彩鮮艷多樣，還各自具有獨特的生理功能，對合成色素形成了有效的補充。如甜椒紅色素色澤光亮、色度穩(wěn)定、視感良好，并可抗氧化、預防動脈粥樣硬化[3]；山楂紅色素具有防癌抗癌、保護大腦、保肝護腎等多重保健功效以及良好的抗氧化和著色能力[4]。

在眾多天然紅色素中，紅棗色素引起了人們的廣泛興趣。紅棗為鼠李科棗屬植物的果實，與桃、李、栗、杏合稱為我國古代的“五果”，是我國北方的重要果樹之一[5]。紅棗的營養(yǎng)成分豐富，不但被譽為“天然維生素丸”，還富含蛋白質(zhì)、糖類、脂肪、有機酸、多種礦物質(zhì)及胡蘿卜素等營養(yǎng)成分[6-7]，以其藥食同源的優(yōu)點受到人們的喜愛[8-9]。其中，新鄭紅棗作為河南特色名棗，歷史悠久、味道醇美，早已享譽中外[10]，除富含食品營養(yǎng)成分外，還含有多酚等多種功能成分[11]。但是，與現(xiàn)代食品工業(yè)相比，傳統(tǒng)的餐飲加工模式對紅棗資源的利用率卻相對較低。例如，紅棗皮中含有大量天然棗皮紅色素，然而在許多食品的加工過程中往往將棗皮遺棄，對資源造成了極大的浪費。

研究表明，棗皮紅色素色澤濃郁純正，對光和熱均較穩(wěn)定，水溶性好，同時具有抗氧化、抗腫瘤、補血養(yǎng)氣、止瀉、抗菌、消除自由基等保健功能，可廣泛用于食品、醫(yī)藥及化妝品著色[12]。當前對棗皮紅色素的提取研究方法主要為溶劑浸提法，輔以超聲波、微波、酶法等輔助提取手段，提取液多為不同濃度的NaOH水溶液[13]。鑒于此，本文擬對多種提取液進行篩選，特別是擴大NaOH之外的其他堿的種類，采用溶劑浸提法對棗皮紅色素進行提取，并考察了超聲波輔助提取法對棗皮紅色素提取效果的影響，最后通過四因素三水平正交試驗法在各單因素較優(yōu)水平的基礎上進一步優(yōu)化提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鄭紅棗：鄭州市丹尼斯超市大學路店；氫氧化鈉(分析純)：天津市永大化學試劑有限公司；氫氧化鉀(分析純)、無水碳酸鈉(分析純)、無水乙酸鈉(分析純)、冰乙酸(分析純)：天津市科密歐化學試劑有限公司；無水碳酸鉀(分析純)：天津市盛奧化學試劑有限公司；無水甲醇(分析純)：西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設備

RHP-500A型微型植物粉碎機 浙江永康市榮浩工貿(mào)有限公司；HWCL-3型集熱式恒溫磁力攪拌器、星火牌C型玻璃儀器氣流烘干器 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；AE224型電子分析天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；DSX-9243型電熱鼓風干燥箱 河南捷隆科技有限公司；FreeZone型真空冷凍干燥儀 美國Labconco儀器公司；SB25-12DTD型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 試驗步驟

1.3.1 紅棗的預處理

參照張紅等的處理方法，選擇顆粒完整飽滿的紅棗，在沸水中煮5 min，然后立即放入冷水中，除去果肉，剝?nèi)椘ぃ?jīng)挑選除雜后，清洗2～3次，將棗皮放入鼓風干燥箱中，于40 ℃條件下烘干至恒重，然后將干棗皮制成棗皮粉末(40目)，置于干燥器中備用。

1.3.2 篩選不同的提取溶液

分別稱取7份干燥后的棗皮粉末(0.5 g/份)，將棗皮粉末置于100 mL圓底燒瓶內(nèi)，分別加入NaOH溶液(0.2 mol/L)、KOH溶液(0.2 mol/L)、K2CO3溶液(0.2 mol/L)、Na2CO3溶液(0.2 mol/L)、乙酸鈉溶液(0.2 mol/L)、甲醇和50%冰乙酸水溶液，設置提取溫度60 ℃、提取時間3 h、料液比1∶20，在此條件下初步提取棗皮紅色素[14]。停止反應，待反應液冷卻至室溫后過濾并濃縮，將濃縮液移至50 mL容量瓶中定容；然后，從中準確稱取5 mL溶液，再次轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中定容。以相應提取溶劑為空白，通過紫外可見分光光度計進行全波段掃描，觀察紫外吸收曲線，確定不同提取溶液中棗皮紅色素的最大吸收波長位置。

1.3.3 單因素試驗設計方案

分別考察溶液濃度(0.1～0.6 mol/L，每組間隔為0.1 mol/L)、料液比(1∶10～1∶35，每組間隔為1∶5)、提取溫度(30～90 ℃，每組間隔為10 ℃)、超聲時間(10～50 min，每組間隔為10 min)、提取時間(1～5 h，每組間隔為1 h)5個單因素條件。保持該5個單因素中的4個因素不變，依次考察溶液濃度、料液比、提取溫度、提取時間、超聲時間等因素變化對提取棗皮紅色素的影響，通過優(yōu)化各單因素條件，使5個單因素提取條件分別達到最優(yōu)水平。

1.3.4 正交試驗設計方案

在5個單因素試驗條件優(yōu)化的基礎上對試驗結(jié)果進行分析，并綜合考慮各因素對棗皮紅色素提取效果的影響。固定超聲波輔助提取時間不變，選取溶液濃度、料液比、提取溫度、提取時間4個因素中的較優(yōu)水平，采用L9(34)正交試驗水平表設計正交試驗，進一步優(yōu)化提取棗皮紅色素的工藝條件。

1.3.5 對最優(yōu)工藝條件的驗證

在正交試驗得出的最優(yōu)提取工藝條件下重復提取棗皮紅色素3次，以便驗證正交試驗結(jié)果，并對驗證試驗的結(jié)果進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同的提取液對棗皮紅色素提取效果的影響

稱取7份棗皮粉末(0.5 g/份)，將之溶于具有相同濃度的不同提取液中，通過紫外可見分光光度計在 300～740 nm波長范圍內(nèi)進行全波段掃描，測得每種提取液的最大吸收波長值，見表1。并在各自的最大吸收波長處測得相應吸光度值A，見圖1。

表1 不同溶液的最大吸收波長Table 1 The maximum absorption wavelength of different solutions

由圖1可知，在相同條件下，KOH溶液作為提取棗皮紅色素的提取試劑時，吸光度值最大，提取效果最好，其次依次是NaOH、Na2CO3、K2CO3、乙酸鈉、冰乙酸水溶液、甲醇。考慮到甲醇屬于有毒試劑，因此不予考慮；KOH和NaOH的化學性質(zhì)相似，綜合考慮二者的安全性、經(jīng)濟性和提取效果，本文選取KOH溶液作為提取溶劑，并在此基礎上進一步優(yōu)化試驗內(nèi)容。

圖1 不同溶液對提取效果的影響Fig.1 Effect of different solutions on the extraction effect

2.2 單因素條件對提取效果的影響

2.2.1 提取溶液濃度對棗皮紅色素提取效果的影響

稱取6份棗皮粉末(0.5 g/份)，分別按照濃度0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mol/L準確配制相應的KOH溶液，以1∶20的料液比在60 ℃油浴中恒溫提取3 h，過濾后定容至50 mL容量瓶中，從中移取5 mL并再次定容至50 mL容量瓶中，在330 nm波長處平行測量3次，其平均吸光度值見圖2。

圖2 不同KOH溶液濃度對提取效果的影響Fig.2 Effect of different KOH solution content on the extraction effect

由圖2可知，隨著提取液中KOH濃度的增大，提取效率隨之增大，當提取液濃度為0.5 mol/L時為最大值。此后，隨著提取液濃度的增加，吸光度值反而減小，因此選取0.5 mol/L的KOH溶液為最佳提取液條件。

2.2.2 料液比對棗皮紅色素提取效果的影響

稱取6份棗皮粉末(0.5 g/份)，分別按照料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35的比例準確量取0.5 mol/L的KOH溶液，在60 ℃油浴中恒溫提取3 h，過濾后定容至50 mL容量瓶中，從中移取5 mL并再次定容至50 mL容量瓶中，在330 nm波長處平行測量3次，結(jié)果見圖3中a。

圖3 不同料液比對提取效果的影響Fig.3 Effect of different solid-liquid ratios on the extraction effect

由圖3中a可知，棗皮紅色素的提取效率隨著料液比的增大而增加，料液比1∶20時為最大值；當料液比大于1∶20后，棗皮紅色素的提取效率隨著料液比的增大而降低。為進一步確認最佳料液比條件，以料液比1∶20為中心，對其兩側(cè)的料液比進行精確篩選，結(jié)果見圖3中b。當料液比從1∶18增至1∶22時，棗皮紅色素的提取效率仍以料液比1∶20時最大，因此選擇1∶20為最佳料液比條件。

2.2.3 提取溫度對棗皮紅色素提取效果的影響

稱取7份棗皮粉末(0.5 g/份)，分別按照0.5 mol/L的KOH溶液和1∶20的料液比，在不同的油浴溫度(30，40，50，60，70，80，90 ℃)下提取3 h，過濾后定容至50 mL容量瓶中，從中移取5 mL并再次定容至50 mL容量瓶中，在330 nm波長處平行測定3次，結(jié)果見圖4中a。

圖4 不同提取溫度對提取效果的影響Fig.4 Effect of different extraction temperatures on the extraction effect

由圖4中a可知，棗皮紅色素的提取效率隨著溫度的上升而增大，在30～80 ℃范圍內(nèi)，溫度越高提取效果越好，80 ℃時效果最佳。當溫度達到90 ℃時，提取效率有所下降，究其原因可能是當溫度過高時棗皮紅色素結(jié)構(gòu)遭到破壞。以80 ℃為中心對其兩側(cè)的溫度進行篩選，試驗結(jié)果見圖4中b。在70～90 ℃范圍內(nèi)進一步精確定位提取溫度，可知當溫度上升到85 ℃時提取效率最高，因此選擇85 ℃為最佳提取溫度條件。

2.2.4 提取時間對棗皮紅色素提取效果的影響

稱取5份棗皮粉末(0.5 g/份)，分別按照0.5 mol/L的KOH溶液、1∶20的料液比、85 ℃的提取溫度提取1～5 h，過濾后定容至50 mL容量瓶中，從中移取5 mL并再次定容至50 mL容量瓶中，在330 nm波長處平行測量3次，結(jié)果見圖5。

圖5 不同提取時間對提取效果的影響Fig.5 Effect of different extraction time on the extraction effect

由圖5可知，在1～3 h內(nèi)，提取效率隨著提取時間的增加而提高，3 h時具有最大值；3～5 h之間，隨著提取時間的延長，提取效率持續(xù)下降。因此，選擇3 h為最佳提取時間條件。

2.2.5 超聲時間對棗皮紅色素提取效果的影響

稱取5份棗皮粉末(0.5 g/份)，分別按照0.5 mol/L的KOH溶液、1∶20的料液比，分別超聲處理10～30 min后，在85 ℃油浴中恒溫提取3 h，過濾后定容至50 mL容量瓶中，從中移取5 mL并再次定容至50 mL容量瓶中，在330 nm波長處平行測量3次，結(jié)果見圖6。

圖6 不同超聲時間對提取效果的影響Fig.6 Effect of different ultrasonic time on the extraction effect

由圖6可知，當超聲時間增長時，棗皮紅色素的提取效率也隨之提高，在超聲時間為20 min時，溶液的吸光度值最大，此后，隨著超聲時間的延長，吸光度值反而下降。超聲時間為20 min時的提取效率遠遠高于其他超聲時間，因此，選擇20 min為最佳超聲提取時間條件。

2.3 正交試驗設計與優(yōu)化

2.3.1 正交試驗設計

由上述5個單因素試驗結(jié)果可知，超聲波輔助提取時間為20 min時提取效果最佳，且遠高于其他時間，因此固定超聲波時間條件不變，對KOH溶液濃度(0.4，0.5，0.6 mol/L)、料液比(1∶19、1∶20、1∶21)、提取溫度(80，85，90 ℃)、提取時間(2，3，4 h)進行四因素三水平正交試驗，從中篩選出棗皮紅色素的最優(yōu)提取方案。正交試驗具體方案見表2，正交試驗結(jié)果見表3。

表2 L9(34)正交試驗因素水平設計表Table 2 The design of factors and levels of L9(34) orthogonal experiment

表3 正交試驗結(jié)果Table 3 The results of orthogonal experiment

由表3中極差R值可知，雖然提取棗皮紅色素的4個單因素條件均對提取效果有影響，但各影響因素的影響力卻存在差異。已知各影響因素對棗皮紅色素提取效果的影響力為：C(提取溫度)>D(提取時間)>A(溶劑濃度)>B(料液比)，其中提取溫度對試驗結(jié)果的影響最顯著。由正交試驗結(jié)果可知，提取棗皮紅色素的最優(yōu)方案應為A3B2C1D3，即KOH溶液濃度0.6 mol/L、料液比1∶20、提取溫度80 ℃、提取時間4 h。

2.3.2 最優(yōu)工藝條件驗證試驗

為確保最優(yōu)工藝條件的真實可靠性，通過3組重復平行試驗對其進行驗證，試驗結(jié)果取平均值，見表4。

表4 重復試驗結(jié)果Table 4 The results of repeated experiment

由表4可知，驗證試驗結(jié)果具有代表性，表明該提取工藝條件合理可行，具有良好的重現(xiàn)性。

3 結(jié)論

本文通過對提取液的篩選，首先確定了以KOH溶液為本試驗的提取溶液，然后對提取棗皮紅色素的各單因素條件進行優(yōu)化。結(jié)果顯示各單因素試驗最佳條件分別為：提取液濃度0.5 mol/L的KOH溶液，料液比1∶20，提取溫度85 ℃，提取時間3 h，超聲時間20 min。通過對試驗結(jié)果的分析，在正交試驗設計中固定超聲波提取時間20 min不變，則正交試驗最佳提取工藝條件為：KOH溶液濃度0.6 mol/L，料液比1∶20，提取溫度80 ℃，提取時間4 h。經(jīng)過3次平行重復試驗的驗證，該最佳工藝條件下棗皮紅色素吸光度值的重現(xiàn)性良好。

由試驗結(jié)果可知，KOH溶液體系對棗皮紅色素的提取效果明顯優(yōu)于當前提取棗皮紅色素時普遍采用的NaOH溶液體系，表明本文對提取棗皮紅色素的工藝條件優(yōu)化結(jié)果的可行性和優(yōu)勢性，也為更深入地研究棗皮紅色素的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的理論支持。