米曲霉功能基因組-蛋白組學(xué)研究及其在發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用

錢曉慶，黃煌，陳茂彬，周冉冉，李可心，張玉*

(1.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 發(fā)酵工程教育部重點實驗室，武漢 430068；2.工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430068；3.工業(yè)微生物湖北省重點實驗室，武漢 430068)

米曲霉(Aspergillusoryzae)是一種好氣性絲狀真菌，歸屬于真菌門、半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、從梗孢科、曲霉屬。米曲霉是通過孢子繁殖，發(fā)芽后長出菌絲，其菌絲在生長初期呈白色，在生長后期呈黃綠色，老化后逐漸變?yōu)楹稚玔1-2]。分生孢子梗生長在足細(xì)胞上，分生孢子頭一般呈放射狀，少數(shù)為疏松柱形，頂囊呈球形或燒瓶形[3]。米曲霉菌落生長速度快、質(zhì)地疏松，最適生長溫度為30～35 ℃，產(chǎn)酶最適宜溫度為28～30 ℃；相對濕度保持在95%左右比較合適；生長的最適pH是6.0左右，偏高或偏低，均不利于米曲霉的菌體中酶的分泌，同時也會影響酶的活力。

米曲霉作為一種絲狀真菌在傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)中發(fā)揮著重要的作用[4]，是酒類釀造、醬類及醬油生產(chǎn)的核心菌株。米曲霉主要通過分泌蛋白酶[5-6]、淀粉酶[7]、糖化酶[8]、纖維素酶[9]等酶類對原料中的蛋白質(zhì)、多糖、纖維素等大分子物質(zhì)進(jìn)行降解，從而提高發(fā)酵制品的風(fēng)味。目前，工業(yè)用酶的50%由絲狀真菌生產(chǎn)[10]，尤其是食品酶和飼料酶[11]。米曲霉易培養(yǎng)，不分泌黃曲霉毒素，1989年美國食品與藥物管理局(FDA)和美國飼料公司協(xié)會認(rèn)定米曲霉為安全微生物菌種(generally regarded as safe， GRAS)[12]。隨著食品工業(yè)的發(fā)展，利用米曲霉等絲狀真菌作為表達(dá)宿主生產(chǎn)蛋白酶、糖化酶和淀粉酶等工業(yè)酶制劑的研究也愈發(fā)廣泛。

我國人口眾多，對發(fā)酵制品的需求量較大，因而成本和品質(zhì)成為較為關(guān)注的問題，為獲得性狀優(yōu)良的米曲霉菌株，更好地應(yīng)用于傳統(tǒng)釀造食品，菌種的選育和改良在現(xiàn)代發(fā)酵菌種技術(shù)中處于重要地位。目前我國傳統(tǒng)釀造行業(yè)中一般是通過測定最終酶活力來反映發(fā)酵性能，從而選育優(yōu)良的米曲霉菌株，人們對于米曲霉分泌的酶系以及相關(guān)基因的調(diào)控也有一定的研究，但系統(tǒng)性的深入研究并不多。本文通過綜述米曲霉功能基因組學(xué)、蛋白組學(xué)以及在發(fā)酵領(lǐng)域中的應(yīng)用研究進(jìn)展，以期為后續(xù)米曲霉的研究提供指導(dǎo)。

1 米曲霉功能基因組學(xué)的研究進(jìn)展

功能基因組學(xué)是利用基因組項目產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)來描述基因和蛋白質(zhì)的功能和相互作用[13]。米曲霉在釀造工業(yè)中的重要應(yīng)用以及高效的胞外蛋白分泌能力與其相關(guān)基因的調(diào)控是分不開的，研究表明米曲霉基因組中有135個胞外蛋白酶基因。全基因組序列的破譯為米曲霉基因組改組技術(shù)提供了基礎(chǔ)。Machida等成功破譯了米曲霉RIB40的基因組，研究發(fā)現(xiàn)米曲霉基因大小為37.9 Mb，大約有3800萬堿基對，8條染色體，長度分別為3.3，3.4，4.1，4.4，4.8，5.0，6.2，6.4 Mb，約1.2萬個基因[14]。表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)技術(shù)和DNA微矩陣技術(shù)的應(yīng)用促進(jìn)了米曲霉功能基因組學(xué)的發(fā)展。目前，大約有10個米曲霉菌株已被測序并存入公共NCBI數(shù)據(jù)庫，這些菌株的基因組大小從35.42～41.16 Mb不等，在1.2萬個左右基因中，只有約200個基因功能被鑒定。對米曲霉基因組基因進(jìn)行GO功能聚類分析發(fā)現(xiàn)，在分子功能方面，水解酶活性、氧化還原酶活性和轉(zhuǎn)運酶活性處在前列；在細(xì)胞組分方面，細(xì)胞核、膜和細(xì)胞質(zhì)位于前三名；在生物過程方面，大量基因參與了糖類、蛋白質(zhì)、脂類代謝以及分泌蛋白加工轉(zhuǎn)運等過程[15]。米曲霉基因組中雖然大多數(shù)量基因是未知的，但是從基因組注釋來看，米曲霉適合作為良好的宿主細(xì)胞用于工業(yè)化生產(chǎn)。根據(jù)基因組所包含的信息來控制米曲霉發(fā)酵，從而提高食品釀造業(yè)的生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量[16]。

米曲霉遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立為進(jìn)一步從基因水平深入研究和基因改良菌株提供了條件。Zhao等[17]通過比較米曲霉RIB40和米曲霉3.042基因組與轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)差異，發(fā)現(xiàn)了2種米曲霉不同的分泌調(diào)控機(jī)制，在米曲霉3.042菌株中發(fā)現(xiàn)了更多的與細(xì)胞生長和環(huán)境抗性相關(guān)的基因，該菌株具有更強(qiáng)的生命力；而米曲霉RIB40特有的Na+、K+、甘油代謝相關(guān)基因較多，該菌株耐鹽脅迫能力較強(qiáng)。在兩個菌株中觀察到許多編碼酶的基因，這些酶對不同的醇、酸和氨基酸的產(chǎn)生有重要影響，在基因水平上分析了兩種米曲霉用于發(fā)酵產(chǎn)品產(chǎn)生不同風(fēng)味的原因。He等[18]通過對米曲霉不同生長階段的轉(zhuǎn)錄組分析，揭示了不同類型基因在生長過程中的動態(tài)變化，利用RNA-seq分析了米曲霉的3個階段，每個樣本產(chǎn)生了2700多萬個高質(zhì)量讀段。分析結(jié)果顯示，從適應(yīng)期向?qū)?shù)期和穩(wěn)定期過渡時，差異基因表達(dá)較多，而從對數(shù)期向穩(wěn)定期過渡時，差異基因表達(dá)相對穩(wěn)定。對米曲霉基因組基因進(jìn)行了GO功能聚類分析，對不同生長階段的差異表達(dá)基因進(jìn)行了分類，發(fā)現(xiàn)這些基因大多在單生物過程、代謝過程和催化活性方面得到了富集。從適應(yīng)期向?qū)?shù)期轉(zhuǎn)化時大多數(shù)基因表達(dá)增加，從對數(shù)期向靜止期的穩(wěn)定表達(dá)主要涉及碳水化合物和氨基酸的代謝，這對米曲霉在發(fā)酵領(lǐng)域的作用從基因?qū)用孢M(jìn)行了解釋。

分析米曲霉分泌的各種酶的表達(dá)基因，將米曲霉進(jìn)行遺傳改造使其成為更加優(yōu)良的菌種，已經(jīng)成為米曲霉研究工作的重要內(nèi)容。傳統(tǒng)的米曲霉菌種改造有化學(xué)誘變、物理誘變、原生質(zhì)體融合法等方法，通過采用常壓室溫等離子體誘變改良米曲霉菌株[19-20]，對比研究發(fā)現(xiàn)突變株產(chǎn)酶能力增強(qiáng)，酶活力均有所提高，氨基酸和還原糖的含量也顯著提高，大大提升了釀造制品的品質(zhì)。Cheevadhanarak等[21]應(yīng)用寡核苷酸探針技術(shù)，從基因文庫中獲得了米曲霉堿性蛋白酶基因，并對該基因的序列進(jìn)行了分析和測定，將該蛋白酶基因轉(zhuǎn)化到米曲霉中，轉(zhuǎn)化株分泌的蛋白酶量為初始菌株的6倍。

新興發(fā)展的選擇性標(biāo)記基因應(yīng)用技術(shù)、染色體大片段刪除技術(shù)和DNA芯片技術(shù)等為米曲霉存在的mRNA的不穩(wěn)定[22]、自身蛋白酶分解錯誤折疊的外源蛋白等不足提供了改善方法[23]，利用基因工程技術(shù)對菌株進(jìn)行改造，如關(guān)鍵酶基因的超表達(dá)、代謝通路的激活、競爭通路的抑制，可顯著提高米曲霉的生產(chǎn)能力。

通過基因組測序得到的編碼蛋白大部分是功能未知的蛋白，功能基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合應(yīng)用，可以對米曲霉功能性蛋白進(jìn)行更深層次的研究，為獲得更多目的蛋白信息提供了研究思路和基礎(chǔ)。

2 米曲霉蛋白組學(xué)的研究進(jìn)展

米曲霉作為絲狀真菌，其分泌物由高度動態(tài)的蛋白質(zhì)組成，包括多種活性酶。蛋白組學(xué)是研究特定條件下蛋白質(zhì)整體水平的存在狀態(tài)及活動規(guī)律，主要包括蛋白質(zhì)樣品的制備、分離以及最終的鑒定。目前，米曲霉蛋白質(zhì)組主要集中在相關(guān)功能性蛋白的表達(dá)情況上，雙向電泳技術(shù)(two-dimentional electrophoresis，2-DE)及基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組分的分析。

Hayakawa等[24]利用淀粉酶-綠色熒光融合蛋白(AmyB-EGFP)，熒光觀察發(fā)現(xiàn)米曲霉胞外蛋白酶系參與分泌途徑主要分布于菌絲頂端，通過頂端分泌的方式分泌至胞外[25]。且在米曲霉中，同源蛋白分泌量可超過10 g/L，而非真菌異源蛋白的表達(dá)量很低。Oda K等[26]運用雙向凝膠電泳技術(shù)，利用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)，通過肽質(zhì)量指紋圖譜比較了米曲霉RIB40在固體和液體培養(yǎng)條件下胞外蛋白的分泌情況，共鑒定出包括淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纖維素降解酶在內(nèi)的29種蛋白。劉曄等[27]以米曲霉ZJGS-LZ-12為研究對象，以米曲霉3.042為對照，運用雙向電泳技術(shù)及生物質(zhì)譜檢測。研究發(fā)現(xiàn)米曲霉ZJGS-LZ-12與米曲霉3.042胞外分泌蛋白組存在顯著差異，差異表達(dá)蛋白點共169個，主要是淀粉水解酶、纖維素酶、半纖維素酶及蛋白質(zhì)酶，其中，淀粉水解酶、半纖維素酶活性顯著增強(qiáng)，這些酶參與糖類和蛋白質(zhì)水解過程，有利于豆制品的發(fā)酵生產(chǎn)。

在定性地明確米曲霉的分泌蛋白后，研究人員在已有的基礎(chǔ)上進(jìn)一步檢測不同條件下米曲霉所產(chǎn)生的酶的酶學(xué)性質(zhì)和活性，毛丙永等[28]從米曲霉3.042中分離純化得到一種耐鹽蛋白酶，并鑒定為鈣蛋白酶RIM13，該蛋白酶在高鹽度環(huán)境下仍具有較高的酶活力，在醬油的發(fā)酵生產(chǎn)中具有較大的應(yīng)用潛力。Zhao等[29]采用2-DE技術(shù)比較米曲霉100-8(米曲霉3.042注入N+誘變而來)和米曲霉3.042的蛋白組學(xué)差異，鑒定出522個胞內(nèi)蛋白，其中451個為差異蛋白點，在米曲霉100-8中，細(xì)胞內(nèi)肽酶、糖酵解酶、tRNA合成酶、乙醇脫氫酶、丙酮酸脫羧酶、硫胺生物合成酶等含量較高，它們參與糖酵解、氨基酸合成代謝、次級代謝過程，這些蛋白與釀造醬油的風(fēng)味相關(guān)，有助于增強(qiáng)醬油的風(fēng)味。國內(nèi)釀造行業(yè)普遍使用的醬油菌種是米曲霉滬釀3.042，產(chǎn)生的蛋白酶以中性蛋白酶和堿性蛋白酶為主，黑婷婷等[30]采用離子注入法誘變經(jīng)選育得到的A100-8菌株，其纖維素酶、糖化酶、蛋白酶活力較原菌種均有提高，有利于后續(xù)食品發(fā)酵的運用。

目前對米曲霉蛋白質(zhì)功能的研究較少，已知功能的蛋白，它們的功能大多數(shù)是利用同源基因功能類推的方法推測出來的，米曲霉分泌蛋白的編碼基因部分見表1，從米曲霉分泌的蛋白質(zhì)入手，有助于更深一步了解基因組并闡明基因的功能，從而更加清晰地了解米曲霉的特性。

表1 米曲霉部分胞內(nèi)胞外蛋白的編碼基因Table 1 Genes encoding of some intracellular and extracellular proteins in Aspergillus oryzae

3 米曲霉在發(fā)酵制品領(lǐng)域的應(yīng)用

米曲霉是一種高產(chǎn)復(fù)合酶的菌株，分泌包括蛋白酶在內(nèi)的多種酶類。按照米曲霉所分泌酶的酶活不同，將其在發(fā)酵領(lǐng)域的應(yīng)用分為兩類：一種是分泌高活性的糖化酶，另一種是分泌高活性的蛋白酶。

高活性糖化酶分解淀粉質(zhì)原料的能力強(qiáng)，把含淀粉和糖質(zhì)原料的物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)生酒精，這種米曲霉一般用于酒類釀造[31-32]。趙中開等[33]通過優(yōu)化純種米曲霉酒曲的制備工藝，使得米曲酶糖化酶活力顯著提高到1110.79 U/g，為米曲霉酒曲的規(guī)模化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。葛祎楠等[34]以板栗作為釀酒原料，通過對4種米曲霉酒曲的感官評價及酶活進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)米曲霉2011作為板栗清酒的糖化曲種，其α-淀粉酶活力為1306.63 U/g，糖化酶活力為324.56 U/g，酸性蛋白酶活力為1036.33 U/g，顯著改善了清酒的風(fēng)味和營養(yǎng)價值。

高活性的蛋白酶分解蛋白質(zhì)的能力強(qiáng)，在醬類[35-37]及醬油[38-39]釀造中運用較多。黃艷等以米曲霉A019為出發(fā)菌株，采用常壓室溫等離子體誘變選育得到突變株ZA131，該突變株生長較快，菌絲較長而孢子較少，產(chǎn)酶能力增強(qiáng)，尤其是蛋白酶提升了38.46%，谷氨酰胺酶提升了18.25%，谷氨酸生成率提升了11.18%，對醬油釀造風(fēng)味的提升有顯著貢獻(xiàn)；丁昊等[40]從米曲霉HDF-7中分離純化獲得的蛋白酶對大豆蛋白進(jìn)行水解，發(fā)現(xiàn)氨基酸含量提高了18.2%，將純化的蛋白酶加入原料中代替制曲，大大縮短了制醬時間。

米曲霉廣泛用于酒類、醬類及醬油的發(fā)酵生產(chǎn)，不僅直接關(guān)系到原料利用率的高低，還進(jìn)一步影響到發(fā)酵速度的快慢、成品的品質(zhì)及風(fēng)味等。因此，通過對米曲霉的功能基因組和蛋白組綜合比較分析研究，對米曲霉基因組-蛋白質(zhì)組信息及功能有了更加清晰的認(rèn)識，對傳統(tǒng)發(fā)酵食品的滋味、風(fēng)味、色澤的調(diào)控具有重要理論價值。

4 結(jié)論

米曲霉是我國傳統(tǒng)食品釀造行業(yè)中的核心菌株，是豆豉、醬油、清酒、黃酒等食品的關(guān)鍵發(fā)酵菌種，米曲霉主要通過分泌蛋白酶、糖化酶、纖維素酶等酶類對原料中的蛋白質(zhì)、多糖、纖維素等大分子物質(zhì)進(jìn)行降解，提高發(fā)酵制品的品質(zhì)。米曲霉全基因組序列已經(jīng)被破譯，但仍有大多數(shù)基因功能尚不明確，因而運用基因組學(xué)遺傳改造技術(shù)來改良米曲霉菌株存在諸多限制和障礙。蛋白質(zhì)作為生命活動的承擔(dān)者，其種類和表達(dá)量都是特定情況下基因選擇性表達(dá)的結(jié)果，因此將功能基因組-蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合起來分析，能夠更加準(zhǔn)確地闡述米曲霉機(jī)體的內(nèi)部調(diào)控和反應(yīng)機(jī)理，將有助于我們更加深入理解米曲霉酶系表達(dá)和酶蛋白分泌的調(diào)控機(jī)制，為有針對性地選育高蛋白酶活和高糖化酶米曲霉菌株提供了理論基礎(chǔ)，從而有效地提升發(fā)酵制品的質(zhì)量并降低生產(chǎn)過程中的成本，為米曲霉在食品行業(yè)的深度開發(fā)利用提供一定的技術(shù)參考。