花色苷脂肪酸脂酚衍生物工藝優化及功能性脂肪酸分析

李珊，孫萬成，羅毅皓

(青海大學 農牧學院，西寧 810016)

牦牛是我國的青藏高原地區最主要的家畜，從其牛奶中提取的脂肪稱為牦牛酥油，性狀類似黃油。牦牛酥油富含多種功能性脂肪酸[1]，且一些功能性脂肪酸含量較普通黃油差異明顯，譬如亞油酸是普通黃油的3倍，花生四烯酸和二十碳五烯酸(EPA)是普通奶油4倍和2倍，二十二碳六稀酸(DHA)含量也較普通奶油中的含量高[2]。

黑枸杞(LyciumruthenicumMurr.)為茄科枸杞屬多棘刺灌木，在我國主要分布于青海、寧夏、甘肅等西部地區，其果實味甜多汁，富含花青素和多糖等多種類活性成分，營養豐富[3]。花青素作為一種植物色素，是單糖通過糖苷鍵連接形成的花色苷[4]，由于花色苷的糖基化B環結構，使其具有較強的抗氧化活性，可以很好地清除自由基[5]。花青素歸屬酚類化合物中的類黃酮類，其最大的特點是具有數量不等的酚羥基[6]。

功能性脂肪酸可以有效降低人體血脂、血糖水平，減少心血管疾病的發病率和死亡率，具有預防癌癥、糖尿病、嬰兒發育不良和神經及精神類疾病的作用[7]，尤其對胃癌、乳腺癌、肝癌等惡性腫瘤具有很強的抑制作用，能使大腦功能和視覺功能最佳化[8]。研究最廣泛的是不飽和脂肪酸n-3系列和n-6系列[9]。不飽和脂肪酸作為多種代謝物(白細胞三烯、羥基脂肪酸和前列腺素)的前體，具有重要的生物活性[10]。由于哺乳動物缺乏合成不飽和脂肪酸的能力，必須進行膳食干預。然而，這種脂肪酸用于預防目的的實際用途是有限的，它們大部分易氧化，發生酸敗，產生不良風味[11]。近年來，人們從一些天然脂酚中發現了兩種物質的結構關系，對具有強抗氧化性的抗氧化劑如多酚類物質與易氧化的化合物進行反應結合生成脂酚衍生物產生了興趣，將天然抗氧化劑與功能性脂肪酸進行反應制備脂酚衍生物，終止脂肪酸氧化的同時提高多酚的脂溶性，可將衍生物復配添加至脂質基質中，將大大拓展多酚的應用市場[12]。Young等[13]將白藜蘆醇與不同鏈長的脂肪酸發生酯化反應，對其進行結構修飾后發現白藜蘆醇衍生物的脂溶性和抗氧化性都有所增強，拓展了其在調味品保鮮及親油性食品中的潛在應用。本研究選擇黑枸杞中提取的花色苷作為抗氧化劑，以牦牛酥油中提取的游離脂肪酸作為酰基供體發生酶法酯化反應制備衍生物，對其反應進行優化，研究反應后功能性脂肪酸是否進行富集，制備功能性脂肪酸含量高的脂酚衍生物，為今后的研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

牦牛酥油：青海省祁連縣；新鮮黑枸杞:青海省格爾木市；三氟化硼甲醇：成都艾科達化學試劑有限公司；南極洲假絲酵母脂肪酶(CALB)：杭州創科生物科技有限公司；AB-8大孔吸附樹脂：東鴻試劑有限公司。分析純正己烷、無水乙醇、異丙醇、氯仿、乙酸乙酯、石油醚、丙酮、甲醇：北京捷聯特科技有限公司；分析純氫氧化鉀、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、濃鹽酸、95%乙醇、氯化鈉、無水硫酸鈉：蘇州清泉化工貿易有限公司。

1.2 儀器與設備

GC-MS-TQ8050 NX氣相色譜-質譜聯用儀 日本島津公司；電熱恒溫水浴鍋 上海比朗儀器有限公司；電熱鼓風干燥箱、MVS-1旋渦混合器、THZ-A2恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司；LC-04C高速4 ℃離心機 江蘇正基儀器有限公司；JM-13 3003電子天平 諸暨市超澤衡器設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑枸杞花色苷提取、分離及純化

參照文獻[14]并稍作改動，稱取2 g黑果枸杞干粉于錐形瓶中，加入50 mL 80%乙醇(1%鹽酸酸化)，避光恒溫超聲輔助提取，保留濾液。將濾液減壓濃縮(50 ℃)，回收乙醇。將50 mL濃縮液置于錐形瓶中，加入5 g樹脂和100 mL蒸餾水，于30 ℃，150 r/min 的恒溫搖床中進行振蕩10 h，使其充分吸附至飽和。將吸附飽和的大孔樹脂充分過濾后，加入pH 3.0的80%酸性乙醇溶液20 mL，于30 ℃，150 r/min的恒溫搖床中進行振蕩處理，使其充分解吸，將解吸液在40 ℃條件下減壓蒸餾，再冷凍干燥，得到純度為85%的黑果枸杞花色苷粉末。

1.3.2 牦牛酥油尿素絡合純化游離脂肪酸

本研究采用皂化-酸化法粗提游離脂肪酸，再經絡合結晶法純化游離脂肪酸。

1.3.3 酶法酯化反應

將花色苷粉末、游離脂肪酸、有機溶劑、分子篩和磁力轉子依次加入到螺旋玻璃反應管中。將反應管放置于設有一定溫度的磁力攪拌器中溶解花色苷粉末。溶解完全后加入催化劑脂肪酶CALB，在一定溫度下反應若干小時后取出。反應完成后，用濾紙濾除酶和分子篩終止反應。用旋轉蒸發器回收乙醇，得到酶法酯化產物粗品。將上述酯化產物粗品用乙酸乙酯-水混合液萃取3次，收集乙酸乙酯層，用旋轉蒸發器濃縮干燥后得到酶法酯化產物。

1.3.4 酶法酯化產物轉化率的計算

1.3.5 單因素試驗

本研究酯化反應以反應溶液、脂肪酶添加量、反應溫度、反應時間和純化后的花色苷與游離脂肪酸底物摩爾比作為單因素進行試驗，并計算酯化反應的轉化率確定，最優反應發生的條件，單因素試驗設計如下：

反應溶劑：取0.50 g花色苷粉末和1.00 g游離脂肪酸加入2.0%(W/W)CALB，在反應溫度為50 ℃、反應時間為12 h的條件下，考察50 mL反應溶劑(乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇)對酯化反應的影響。

脂肪酶添加量：取0.50 g花色苷粉末和1.00 g游離脂肪酸加入到裝有50 mL乙醇的螺旋玻璃反應管中，在反應溫度為50 ℃、反應時間為12 h的條件下，考察脂肪酶添加量(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)對酯化反應的影響。

反應溫度：取0.50 g花色苷粉末和1.00 g游離脂肪酸混合到裝有50 mL乙醇的螺旋玻璃反應管中，加入2.0%(W/W)CALB，在反應時間為12 h的條件下，考察反應溫度(40，45，50，55，60 ℃)對酯化反應的影響。

反應時間：取0.50 g花色苷粉末和1.00 g游離脂肪酸加入2.0%(W/W)CALB，在反應溫度為50 ℃的條件下，考察反應時間(4，8，12，16，20 h)對酯化反應的影響。

花色苷與游離脂肪酸底物摩爾比：取花色苷粉末和游離脂肪酸不同底物摩爾比加入2.0%(W/W)CALB，在反應溫度為50 ℃、反應時間為12 h的條件下，考察花色苷與游離脂肪酸不同摩爾比(1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3)對酯化反應的影響。

1.3.6 響應面法優化酯化反應工藝條件

根據單因素試驗確定的因素和水平，采用響應面設計最佳反應條件。根據Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，研究脂肪酶添加量(A)、反應溫度(B)、反應時間(C)、底物摩爾比(D)對酯化反應轉化率的影響。

1.3.7 脂肪酸組成分析

1.3.7.1 樣品甲酯化

取適量樣品，加入5 mL正己烷溶解，加入0.5 mol/L氫氧化鉀甲醇溶液，超聲10 min，定容至10 mL，靜置2 h，取上清液，加入無水硫酸鈉除水后待GC-MS分析使用。

1.3.7.2 GC-MS分析

GC-MS條件：進樣量1 μL，汽化溫度：280 ℃，氣體流量：50 mL/min，載氣：氦氣。

升溫程序：150 ℃(5 min)，5 ℃/min→200 ℃(6 min)，2 ℃/min→230 ℃(25 min)。

質譜條件：DB-5MS色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；離子源溫度：250 ℃；接口溫度：285 ℃。

1.3.8 數據處理

采用Excel 2007進行數據處理，結合 SPSS 數據處理軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗分析

2.1.1 反應溶液對酶法酯化反應的影響

5種不同的反應溶劑作為發生反應的介質，對酯化反應轉化率的影響見圖1。

圖1 反應溶液對酶法酯化反應轉化率的影響 Fig.1 Effect of reaction solution on conversion rate of enzymatic esterification

由圖1可知，反應溶劑為乙醇時，酯化反應的轉化率最高，這可能與有機溶劑的油水分配系數(log p)值有關。Laane等[15]研究發現反應酶活與有機溶劑的log p值有關，有機溶劑的log p值越低，反應轉化率越高。本研究選用5種不同的有機溶劑，乙酸乙酯(log p=0.68)、甲醇(log p=-0.76)、乙醇(log p=-0.24)、丙酮(log p=-0.23)、異丙醇(log p=0.28)。作為反應溶劑，酶法酯化反應轉化率依次為乙醇>丙酮>甲醇>異丙醇>乙酸乙酯。因此，試驗選擇乙醇為反應溶劑。

2.1.2 脂肪酶添加量對酶法酯化反應的影響

反應中添加不同量的脂肪酶對酯化反應轉化率的影響見圖2。

圖2 脂肪酶添加量對酶法酯化反應轉化率的影響Fig.2 Effect of lipase additive amount on conversion rate of enzymatic esterification

脂肪酶作為催化劑會直接影響反應速率及達到平衡的時間，是影響酯化反應的一個重要因素。由圖2可知，選用的CALB對酯化反應的催化效果明顯。添加1.0%的脂肪酶時，酯化反應的轉化率為65.67%。當脂肪酶添加量為2.0%時，酶法酯化反應的轉化率最高，可達88.20%。當脂肪酶添加量超過2.0%后，反應轉化率呈現下降趨勢，這可能是因為適量的酶作為催化劑可以加速反應的進行，但過量會導致酶與底物的接觸面積減少，從而降低酶與底物的活性位點的接觸，最終影響反應的進行[16]。因此，確定脂肪酶添加量為2.0%。

2.1.3 反應溫度對酶法酯化反應的影響

反應溫度對酶法酯化反應的影響見圖3。

圖3 反應溫度對酶法酯化反應轉化率的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on conversion rate of enzymatic esterification

由圖3可知，酶法酯化反應的轉化率隨著溫度的升高而增加，當溫度達到50 ℃時，反應的轉化率最高，達86.20%。對于酯化反應而言，提高溫度可以促進底物分子之間的碰撞，從而加快反應速率，當溫度達到酶的最適溫度時，酶的活性最高[17]。繼續提高溫度，轉化率有下降的趨勢。由于酯化反應是吸熱的可逆反應，當溫度過高時會發生水解反應，導致轉化率下降[18]。且超過酶最適溫度的高溫會使酶活性及選擇性喪失，也會導致轉化率降低。因此，選擇50 ℃為酶法酯化反應的最佳溫度。

2.1.4 反應時間對酶法酯化反應的影響

反應時間對酶法酯化反應的影響見圖4。

圖4 反應時間對酶法酯化反應轉化率的影響Fig.4 Effect of reaction time on conversion rate of enzymatic esterification

由圖4可知，當反應時間由4 h增加到12 h時，發現酶法酯化反應的轉化率顯著增加。當反應時間為12 h時，轉化率高達86.10%。當反應時間超過12 h后，反應轉化率無明顯差異，表明反應趨于平穩，考慮試驗條件及效率，選擇12 h為酶法酯化反應的最佳反應時間。

2.1.5 花色苷與游離脂肪酸底物摩爾比對酶法酯化反應的影響[19]

花色苷與游離脂肪酸底物摩爾比對酶法酯化反應的影響見圖5。

圖5 底物摩爾比對酶法酯化反應轉化率的影響Fig.5 Effect of substrate molar ratio on conversion rate of enzymatic esterification

酯化反應作為一個可逆反應，底物的用量是影響轉化率的一個重要因素。由圖5可知，將花色苷粉末與脂肪酸質量比從1∶1增加到1∶2時，反應的轉化率明顯提高，最高達86.5%。當底物質量比超過1∶2時，反應的轉化率開始降低，這是因為當脂肪酸含量較多時會稀釋脂肪酶的濃度，影響酶的催化作用，從而降低轉化率。

2.2 響應面法優化酯化反應工藝條件

根據單因素試驗確定的因素和水平，采用響應面設計確定最佳工藝條件。根據Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，研究了脂肪酶添加量(A)、反應溫度(B)、反應時間(C)、底物摩爾比(D)對酶法酯化反應轉化率的影響。響應面試驗因素與水平和響應面試驗設計及結果見表1和表2。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Response surface experimental factors and levels

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Response surface experimental design and results

2.2.1 轉化率的響應面模型的建立與方差分析

各因素經回歸擬合得到轉化率與脂肪酶添加量、反應時間、反應溫度和底物摩爾比的二次多項式回歸模型:Y=+86.80+8.67A+7.02B+0.53C+12.73D-0.88AB-0.32AC-9.95AD+3.03BC+8.80BD-1.35CD-0.65A2-10.65B2-3.43 C2-9.45D2。

該模型的方差分析見表3。

表3 轉化率方差分析Table 3 Analysis of variance of conversion rate

續 表

由表3可知，該模型的P<0.01，差異顯著。失擬項的P=0.5320>0.05，不顯著，說明模型可以很好地預測酶法酯化反應的轉化率，具有實際應用意義。脂肪酶添加量(A)、反應溫度(B)、反應時間(C)、底物摩爾比(D)對轉化率的影響均顯著；影響反應轉化率的順序依次是A>B>C>D。

2.2.2 響應面試驗優化最佳條件及模型的驗證

利用Design Expert軟件進行嶺脊分析，得到模型最佳點為：脂肪酶添加量1.90%、反應溫度53.90 ℃、底物摩爾比1∶2.03、反應時間11.36 h。在此條件下轉化率預測值為92.60%。結合實際條件，選擇脂肪酶添加量2.0%、反應溫度50 ℃、底物摩爾比1∶2、反應時間12 h進行驗證，得到反應轉化率為91.55%。試驗值與預測值相近，表示響應面試驗優化得到的方案可靠。

2.3 游離脂肪酸與酶法酯化產物的脂肪酸組成分析

對游離脂肪酸和脂酚產物進行甲酯化處理，用GC-MS檢測分析兩者的脂肪酸組成成分，圖譜見圖6和圖7，脂肪酸成分見表4。

圖6 反應前脂肪酸GC-MS譜圖Fig.6 GC-MS spectra of fatty acid before reaction

圖7 反應后脂肪酸GC-MS譜圖Fig.7 GC-MS spectra of fatty acid after reaction

表4 酯化反應前后脂肪酸含量變化(平均值±標準差)Table 4 Changes in fatty acid content before and after esterification %

由表4可知，反應前提取的游離脂肪含有1.12%的支鏈脂肪酸，酯化反應得到的產物支鏈脂肪酸含量增加了25.62%，是反應前的23倍。支鏈脂肪酸作為一種具有特殊結構的脂肪酸，與直鏈脂肪酸相比氧化穩定性更好，具有降脂、抗炎、抗癌等生理活性。飽和脂肪酸含量從 56.18%下降至27.64%。人體攝入過量的飽和脂肪酸會導致動脈粥樣硬化等疾病，本試驗中飽和脂肪酸含量的降低可能是因為部分脂肪酸在酶促作用下轉化成了不飽和脂肪酸。多不飽和脂肪酸含量增加了4.38%，尤其是DHA增加了3.24%。本研究富集的脂肪酸主要是n-6多不飽和脂肪酸，其中亞油酸7.71%，DHA 3.24%，γ-亞麻酸的代謝物PGE1 33.55%。PGE1是γ-亞麻酸的環氧合酶代謝物，在體內可以轉變成具有擴張血管作用的前列腺環素(PGI2)，保持與血管收縮素的平衡，防止血栓的形成。

3 結論

將花色苷粉末與游離脂肪酸在脂肪酶CALB的催化下發生酯化反應合成脂酚產物，通過單因素試驗和響應面法優化試驗條件獲得脂肪酸轉化率最高的工藝條件為：脂肪酶添加量為2%，反應溫度為50 ℃，反應時間為12 h，底物摩爾比為1∶2，該條件下酯化反應的轉化率最高可達，91.55%。將經過甲酯化處理的游離脂肪酸和脂酚產物進行GC-MS檢測，分析比較兩者的脂肪酸組成成分。結果表明酯化產物脂酚衍生物功能性脂肪酸明顯富集，支鏈脂肪酸和多不飽和脂肪酸都顯著增加，飽和脂肪酸含量降低。

本研究為今后多酚與脂肪酸結合研究提供了思路與參考。將親水性的多酚提高脂溶性的同時添加脂質基質，使功能性脂肪酸有所富集，不僅可以拓寬花色苷等多酚物質作為天然抗氧化物在食品中的應用，而且可憑借富集的功能性脂肪酸應用于功能性食品中。