不同溫度對紅曲霉液態發酵合成紅曲黃色素及桔霉素的影響

況嘉鈾，屈廷啟，韋勝，王偉平*

(1.湖北工業大學 生物工程與食品學院，武漢 430068；2.湖北工業大學 工程技術學院，武漢 430068)

紅曲色素是紅曲霉發酵過程中產生的天然、可食用的色素，具有著色力強、穩定性好等優點[1]，但是紅曲霉發酵過程中還會產生真菌毒素——桔霉素[2]，嚴重影響食品安全，因此如何降低紅曲產品中桔霉素的含量已經成為紅曲色素研究領域的重點問題。目前，為了控制紅曲霉發酵過程中桔霉素的合成量，同時保證紅曲色素的產率，國內外學者分別從菌種的選育、發酵工藝優化[3-4]、基因分子水平調控[5]等方面進行研究，取得了較大進展。周珂等[6]通過液態發酵條件優化使紅曲黃色素達到了108.38 U/mL，Kumiar等[7]通過優化培養基將紅曲色素的總產量提高了1.5倍；蔣冬花等[8]在基因分子水平上將紅曲霉色素相關基因(PigE)取代潮霉素抗性基因(hph)，得到1株高產紅曲黃色素產量為9232.86 U/g的基因工程M-piy菌株，比野生菌株提高了9.6倍，而桔霉素的含量顯著降低。

溫度是影響紅曲霉生長代謝的一個重要因素[9-11]。Tao等發現當發酵溫度從30 ℃增加到35 ℃時，有利于強熒光紅曲黃色素的生成。管宏偉等[12]發現當發酵溫度從26 ℃增加到30 ℃時黃色素的生成量提高了1倍，不同溫度下紅曲黃色素的生成存在明顯差異。本文研究了不同溫度對紅曲霉合成紅曲黃色素及桔霉素的影響，分析比較了發酵液的終止pH值，研究結果為紅曲色素發酵過程中的溫度控制提供了理論依據，對于食品安全型紅曲色素的生產過程控制具有一定指導意義。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

紅曲霉(Monascus)GN：由湖北工業大學生物工程實驗室保藏。

大米粉、黃豆粉：均為食用級；葡萄糖、蛋白胨、可溶性淀粉、瓊脂、KH2PO4、MgSO4·7H2O等：均為國藥分析純；乙腈：色譜純。

1.2 儀器與設備

雷磁PHS-3C pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；GI65DWS立式自動壓力蒸汽滅菌器 致微(廈門)儀器有限公司；ZGJH-1214垂直流超凈工作臺、ZHWY-2112B雙層特大容量全溫度恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；DNP-9052型電熱恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司； Thermo Fisher ST16R高速冷凍離心機 賽默飛世爾科技(中國)有限公司；722S可見光分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；高效液相色譜儀 美國安捷倫公司。

1.3 培養基

斜面培養基：葡萄糖6%、蛋白胨2%、可溶性淀粉3%、瓊脂3%，115 ℃滅菌30 min。

種子培養基：大米粉2%、黃豆粉1%、葡萄糖1%、蛋白胨1%、KH2PO40.5%、MgSO4·7H2O 0.05%，接種搖瓶培養，裝液量為200 mL/500 mL三角瓶，121 ℃滅菌20 min。

發酵培養基：大米粉5%、黃豆粉1%、(NH4)2SO40.5%、KH2PO40.5%、MgSO4·7H2O 0.05%、KCl 0.05%、FeSO4·7H2O 0.0005%、MnSO4·H2O 0.003%、ZnSO4·7H2O 0.0005%，100 mL/250 mL三角瓶，121 ℃滅菌20 min。

1.4 方法

1.4.1 培養方法

斜面培養：挑取1環紅曲霉GN于斜面培養基上，30 ℃培養7 d。

液體種子培養：用接種環在長好的斜面培養基中刮取2環接種到種子培養基中，30 ℃，200 r/min培養2 d。

液體發酵培養：將種子液按體積分數10%接種至發酵培養基，分別在不同溫度(20，22.5，25，27.5，30 ℃)下，以200 r/min搖瓶培養7 d。

1.4.2 pH值的測定

采用pH計測定。

1.4.3 紅曲黃色素色價的測定

移取1 mL發酵液加入9 mL 70%的乙醇溶液，置于60 ℃恒溫搖床中，200 r/min萃取1 h，4000 r/min離心15 min，取上清液稀釋至20倍，在410 nm處測定黃色素的吸光度。計算結果為OD值乘以稀釋倍數[13]。

紅曲黃色素的色價E(U/mL)=吸光度×200。

1.4.4 桔霉素的測定

HPLC色譜法：取發酵液5 mL，加入10 mL的無水乙醇，在60 ℃恒溫搖床中，200 r/min萃取1 h，在8000 r/min的條件下離心10 min，吸取上清液，經0.45 μm有機濾膜過濾，即得待測液。

HPLC色譜條件[14]：流動相：V(超純水，用磷酸調pH至 2.5)∶V(乙腈)為50∶50；熒光檢測：λex=331 nm，λem=500 nm；色譜柱：Eclipse XDB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；體積流量：1 mL/min；柱溫28 ℃；上樣量：標準品及樣品均為20 μL。

2 結果與分析

2.1 溫度對發酵液終止pH值的影響

圖1 不同發酵溫度對紅曲霉終止pH值的影響Fig.1 Effect of different fermentation temperatures on the pH values of Monascus at the end of fermentation

在不同發酵溫度下，紅曲霉發酵液的終止pH值存在明顯差異。由圖1可知，隨著發酵溫度的降低，發酵終止pH值逐漸降低。在20 ℃時最低，pH值為2.89；30 ℃時最高，pH值為4.38。溫度對發酵過程中的影響主要表現為影響微生物生長過程中的酶反應速率和生物合成途徑。微生物在不同溫度的發酵過程中代謝產生的有機酸存在明顯區別[15]，如酵母菌在20 ℃時代謝產乙酸的能力強于25 ℃和30 ℃[16]；乳酸菌在不同溫度下隨著時間的變化，總酸呈現出不同的差異性[17]。紅曲霉在不同溫度下發酵終止pH值存在差異，這可能是因為溫度的改變影響了紅曲霉生長過程中淀粉酶、糖化酶等多種酶的酶活性和有機酸等酸性物質的合成，導致隨著發酵溫度的降低，終止pH值逐漸降低。

2.2 溫度對紅曲色素合成的影響

不同發酵溫度下紅曲黃色素色價的測定結果見圖2。

圖2 不同發酵溫度對紅曲黃色素合成的影響 Fig.2 Effect of different fermentation temperatures on the synthesis of Monascus yellow pigment

由圖2可知，黃色素隨著溫度的升高先是呈現上升的趨勢，在22.5 ℃時達到最大值(黃色素色價為117.8 U/mL)，然后逐漸下降，在30 ℃時色素產量最低(黃色素色價為45.6 U/mL)。紅曲霉發酵合成的紅曲色素與H+的濃度密切相關[18]，Li等[19]發現pH值為3時的酸性發酵條件下，可以積累大量高純度(79.1%)的紅曲橙色素，所得橙色素的色價為76 U/mL。楊建等[20]研究發現當紅曲霉固態發酵過程中補水(pH 4)時，總色價和橙色價可以達到最大值，分別為6600 U/g和2640 U/g；周波等[21]發現硝酸銨為氮源時會促進胞外黃色素的分泌，但對黃色素總生成量并沒有促進合成的效果，其黃色素色價最高為44.4 U/mL。低溫條件改變了發酵液中有機酸的組成，導致紅曲色素的合成與分泌發生了改變。過低的pH值會影響紅曲色素的生物合成[22]。20 ℃時終止pH值較低(pH<3)，抑制了紅曲黃色素的合成代謝，而22.5，25，27.5 ℃時表現為較高紅曲色素的生物合成。

2.3 溫度對桔霉素合成的影響

不同溫度對桔霉素合成的影響見圖3。

由圖3可知，桔霉素生成量隨著溫度的升高而呈現先增加后逐漸降低的趨勢，與紅曲黃色素的合成趨勢相近。20 ℃時的桔霉素合成量為1.89 mg/L，隨著溫度的升高，當發酵溫度為22.5 ℃時達到最大值，桔霉素的生成量為4.38 mg/L，而后又隨著溫度的升高而逐漸降低，當發酵溫度為30 ℃時，桔霉素的合成量為1.71 mg/L，此時的桔霉素合成量最少。在20，25，27.5，30 ℃條件下，桔霉素的生物合成量較為接近，處于1.7～1.9 mg/L范圍內。在2.1中得到20 ℃時終止pH值低于3，此時的桔霉素生物合成受到了抑制，隨著溫度的升高，發酵終止pH值大于3，抑制桔霉素合成的能力減弱。結果表明桔霉素的合成可能與發酵過程中的pH值具有一定的相關性，穆洪霞[23]發現當pH為2左右時，紅曲霉發酵液中幾乎無法檢測到桔霉素的生物合成，Kang B等發現發酵過程中的pH值變化可以調節桔霉素的生物合成，在極低的初始pH條件下不會合成桔霉素。Xiong Xu等[24]以玉米粉∶小麥淀粉(30∶30，g/L)為底物，玉米、小麥等農作物具有良好的緩沖性，在紅曲霉發酵過程中使pH保持在2.6～3，桔霉素在TLC分析中未檢測到。另一方面，Chen等[25]研究紅曲霉本身具有代謝桔霉素的能力，當溫度相對較高時紅曲霉能分解桔霉素進行再次利用，最終導致22.5～30 ℃時桔霉素依次降低。

圖3 不同發酵溫度對桔霉素含量的影響 Fig.3 Effect of different fermentation temperatures on citrinin content

3 結論

低溫條件改變紅曲霉GN發酵過程中的pH值，研究低溫條件對紅曲霉GN生物合成紅曲黃色素及桔霉素的影響。低溫條件下改變紅曲霉發酵過程的pH值，使終止pH處于2.8～4.4，在此pH值下有利于紅曲色素的生物合成，但也有利于桔霉素的生物合成。20 ℃時發酵終止pH值為2.89(pH<3)，表現為抑制紅曲黃色素及桔霉素的合成代謝，此時的紅曲黃色素和桔霉素表現為急劇降低，22.5 ℃時紅曲色素的合成量達到最大值，但桔霉素的合成量也達到了最大值，而在25 ℃時，紅曲色素的含量與22.5 ℃時接近，桔霉素含量卻與20，27.5，30 ℃時相差不大，相較于其他溫度，25 ℃更適合紅曲黃色素的發酵生產。