參附注射液對失血性休克小鼠核因子-κB受體活化因子配體/骨保護(hù)素(RANKL/OPG)信號通路及腸屏障功能的影響※

于士昌 翟建賓 趙臣亮 趙宏達(dá) 趙 亮

(河北省中醫(yī)院心胸外科，河北 石家莊 050011)

失血性休克(hemorrhagic shock，HS)是臨床常見病癥，主要由主動脈瘤破裂、消化道大出血、手術(shù)創(chuàng)傷、外傷等導(dǎo)致體內(nèi)血液大量丟失，嚴(yán)重時可導(dǎo)致死亡[1-2]。HS可誘導(dǎo)患者體內(nèi)產(chǎn)生大量炎癥因子，引發(fā)嚴(yán)重的炎性反應(yīng)，引發(fā)腸屏障功能受損、腸黏膜通透性增高，造成腸道細(xì)菌移位，最終因腸源性膿毒血癥引起多器官功能障礙，是導(dǎo)致患者病亡的主要原因[3-5]。核因子-κB受體活化因子配體/骨保護(hù)素(RANKL/OPG)信號通路是調(diào)控骨代謝的主要信號通路，也可參與調(diào)控炎性反應(yīng)，下調(diào)RANKL/OPG表達(dá)可降低炎癥因子水平，減少牙周組織炎癥細(xì)胞浸潤，顯著抑制牙槽骨丟失[6]。另外研究發(fā)現(xiàn)，RANKL/OPG在炎癥性腸病中高表達(dá)，與促炎因子白細(xì)胞介素8(IL-8)表達(dá)呈正相關(guān)[7]，提示RANKL/OPG有望成為改善HS引發(fā)的腸屏障功能障礙的作用靶點(diǎn)。參附注射液來源于參附湯，主要由人參、附子2味中藥組成，可溫陽，益氣，固脫，主治陽虛、厥脫諸證?，F(xiàn)代藥理研究表明，參附注射液能改善微循環(huán)、血壓，在HS的臨床搶救中應(yīng)用廣泛，并可降低膿毒癥患者氧化應(yīng)激水平，改善腸屏障功能損傷癥狀[8-9]。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建HS小鼠模型，觀察參附注射液對HS小鼠RANKL/OPG信號通路及腸屏障功能的影響，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級BALB/c雄性小鼠72只，體質(zhì)量18～22 g，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司，動物合格證號：SCXK(魯) 20190003。飼養(yǎng)在中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院動物房中，室內(nèi)保持清潔，通風(fēng)良好，噪聲低于80 db，晝夜交替光照，溫度約23 ℃，相對濕度約55%。

1.1.2 主要試劑 參附注射液[華潤三九(雅安)藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z51020664]；林格液(上海聯(lián)邁生物工程有限公司，貨號LM25-03060)；OCT包埋劑(上海鑫樂生物科技有限公司，貨號14020108926)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒、高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液(北京索萊寶科技有限公司，貨號分別為G1120、BC0020、BC0170、R0010)；小鼠腸型脂肪酸結(jié)合蛋白(I-FABP)檢測試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，貨號ZN2607)；二胺氧化酶(DAO)測試盒(南京建成生物工程研究所，貨號A088-2)；小鼠IL-1β酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、兔源Anti-β-Tubulin一抗、兔源Anti-RANKL一抗、兔源Anti-OPG一抗(美國Abcam公司，貨號分別為ab197742、ab100713、ab102536、ab6046、ab9957、ab73400)。

1.1.3 主要儀器 血壓測量儀(BP100型，上海玉研科學(xué)儀器有限公司)，冰凍切片機(jī)(CM1950型，德國Leica公司)，光學(xué)顯微鏡(Olympus CKX41型，德國Leica公司)，電泳儀(JS-power600型，上海培清科技有限公司)，酶標(biāo)儀(Elx800型，美國Bio-Rad公司)，轉(zhuǎn)膜儀(Power-pac 3000型，美國Bio-Rad公司)，凝膠成像分析儀(ImageMaster型，Applied Biosystems公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組 將72只BALB/c小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，即假手術(shù)組、模型組、林格液組、參附注射液低劑量+林格液組、參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組，每組各12只。

1.2.2 HS小鼠模型建立 除假手術(shù)組小鼠外，其余5組小鼠均參照文獻(xiàn)[10]，以15 mg/kg的劑量注射5%戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行麻醉，固定在操作臺，分離小鼠雙側(cè)股動脈并置管，其中一側(cè)股動脈導(dǎo)管連接血壓測量儀，持續(xù)測量小鼠血壓，經(jīng)另一側(cè)股動脈導(dǎo)管取血，至小鼠血壓降至30 mmHg(3.99 kPa)，記錄小鼠取血量，維持血壓在(30±5)mmHg狀態(tài)90 min，即完成HS小鼠造模。假手術(shù)組小鼠只分離雙側(cè)股動脈并置管，不取血。

1.2.2 給藥 HS小鼠造模完成后，各藥物處理組立刻經(jīng)取血側(cè)股動脈導(dǎo)管補(bǔ)液，均在30 min內(nèi)完成補(bǔ)液。林格液組小鼠予取血量3倍的林格液補(bǔ)液[11]；參附注射液低劑量+林格液組、參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組將參附注射液溶于林格液，配制成2.5、5.0、10.0 mL/kg的藥液[11]，分別予取血量3倍的上述藥液補(bǔ)液；假手術(shù)組、模型組小鼠不進(jìn)行補(bǔ)液處理。

1.3 標(biāo)本采集及檢測方法

1.3.1 小鼠小腸組織病理損傷檢測 補(bǔ)液完成后6 h，各組小鼠經(jīng)股動脈導(dǎo)管取血3 mL，然后取下雙側(cè)導(dǎo)管，處死小鼠。血液經(jīng)離心后，將上層血清保存于-80 ℃?zhèn)溆?；開腹取出小腸組織，剪下約1.0 g，剪碎后置于勻漿管中，加入高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液1.5 mL，4 ℃勻漿后離心，取上清液，按照試劑盒說明書，用BCA法測得其中總蛋白濃度，在-80 ℃保存?zhèn)溆茫黄渌∧c組織置于0.9%氯化鈉注射液中漂洗后，置于4%多聚甲醛溶液中固定，24 h后以30%蔗糖溶液脫水，48 h后加入OCT包埋劑，放置在-25 ℃包埋，最后以冰凍切片機(jī)切片，將所得冰凍切片取出，于室溫放置30 min、4 ℃丙酮固定10 min、3%過氧化氫(H2O2)溶液孵育5 min、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌2次后，按照試劑盒說明書指導(dǎo)進(jìn)行HE染色，最終封片，光學(xué)顯微鏡下觀察著色情況并任選5個視野拍照。根據(jù)小腸黏膜組織病理形態(tài)，進(jìn)行Chiu評分[12]：正常腸黏膜評0分；絨毛頂端黏膜下出現(xiàn)間隙評1分；黏膜下間隙擴(kuò)大，腸黏膜與黏膜下層分離評2分；黏膜與黏膜下層分離延伸到腸絨毛兩側(cè)評3分；絨毛變鈍，固有層及其血管暴露，炎性組織浸潤評4分；固有層消化崩解，出血或形成潰瘍評5分。

1.3.2 小鼠小腸組織MDA、SOD水平和血清DAO、I-FABP、IL-1β、IL-6水平檢測 取出1.3.1中保存于-80 ℃的血清和小腸組織蛋白樣品液，提前在冰水浴中凍融，各取出300 μL，小腸組織蛋白樣品液中MDA、SOD水平采用可見分光光度法測定：向各組樣品液中加入各步驟相關(guān)試劑，以可見分光光度計(jì)測定560 nm(SOD)、600 nm(MDA)下的吸光度，計(jì)算SOD、MDA含量，具體步驟參照各試劑盒說明書進(jìn)行。血清DAO水平采用紫外比色法測定：向各組樣品液中加入各步驟相關(guān)試劑，以全自動生化分析儀測定340 nm波長下的吸光度，計(jì)算DAO含量，具體步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行；血清I-FABP、IL-1β、IL-6水平采用ELISA法測定：向包被過的酶標(biāo)板中加入稀釋液和樣品液，混勻后37 ℃溫育30 min，洗滌后加入酶標(biāo)試劑溫育30 min，再次洗滌后加入顯色劑，37 ℃避光顯色15 min，加終止液終止反應(yīng)，測定450 nm波長下的吸光度，計(jì)算I-FABP、IL-1β、IL-6含量，具體步驟參照各自試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3 小鼠小腸組織RANKL/OPG通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測 1.3.2中剩余的小腸組織蛋白樣品液，加入上樣緩沖液并于100 ℃下變性，各取含20 μg蛋白的樣品液，加入配制好的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS- PAGE)凝膠上樣孔中，使用110 V恒定電壓電泳后濕轉(zhuǎn)，以5%的脫脂牛奶室溫孵育硝酸纖維膜1.5 h，封閉其上轉(zhuǎn)移的蛋白，裁剪膜，分離目的蛋白條帶，加入兔源Anti-β-Tubulin一抗、兔源Anti-RANKL一抗、兔源Anti-OPG一抗溶液，4 ℃孵育過夜后以TBST溶液洗膜，室溫孵育羊抗兔二抗溶液，2 h后以TBST溶液洗膜，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色后以凝膠成像分析儀采集蛋白條帶圖像，通過Image -Pro plus軟件分析各條帶灰度值，得出各目的蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠小腸黏膜組織病理變化 假手術(shù)組小鼠小腸組織黏膜正常，無病理變化；模型組小鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞壞死、絨毛破壞、塌陷，組織水腫嚴(yán)重，且有大量炎癥細(xì)胞浸潤，病理損傷最嚴(yán)重；林格液組小鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞壞死明顯，絨毛形態(tài)排列紊亂、破壞重、組織充血明顯，可見少量炎癥細(xì)胞浸潤，病理損傷次嚴(yán)重；參附注射液低劑量+林格液組小鼠小腸黏膜上皮絨毛膜變鈍、黏膜與黏膜下層分離，組織水腫減輕，病理損傷稍減輕；參附注射液中劑量+林格液組小鼠小腸黏膜下間隙擴(kuò)大，絨毛膜變短，組織稍水腫，病理損傷減輕；參附注射液高劑量+林格液組小鼠小腸黏膜出現(xiàn)間隙，組織稍水腫，病理損傷最輕。見圖1。

圖1 各組小鼠小腸黏膜組織病理變化(HE，×400)

2.2 各組小鼠小腸黏膜Chiu評分比較 見表1。

表1 各組小鼠小腸黏膜Chiu評分比較 分，

由表1可見，模型組小鼠小腸黏膜Chiu評分高于假手術(shù)組(P<0.05)；林格液組、參附注射液低劑量+林格液組、參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組小鼠小腸黏膜Chiu評分均低于模型組(P<0.05)； 參附注射液低劑量+林格液組、參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組小鼠小腸黏膜Chiu評分均低于林格液組(P<0.05)；參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組小鼠小腸黏膜Chiu評分均低于參附注射液低劑量+林格液組(P<0.05)，參附注射液高劑量+林格液組小鼠小腸黏膜Chiu評分低于參附注射液中劑量+林格液組(P<0.05)，參附注射液低、中、高劑量+林格液組之間呈劑量依賴性。

2.3 各組小鼠血清DAO、I-FABP水平比較 見表2。

由表2可見，模型組小鼠血清DAO、I-FABP水平均高于假手術(shù)組(P<0.05)；林格液組、參附注射液低劑量+林格液組、參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組小鼠血清DAO、I-FABP水平均低于模型組(P<0.05)；參附注射液低劑量+林格液組、參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組小鼠血清DAO、I-FABP水平均低于林格液組(P<0.05)；參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組小鼠血清DAO、I-FABP水平均低于參附注射液低劑量+林格液組(P<0.05)，參附注射液高劑量+林格液組小鼠血清DAO、I-FABP水平均低于參附注射液中劑量+林格液組(P<0.05)，參附注射液低、中、高劑量+林格液組之間呈劑量依賴性。

表2 各組小鼠血清DAO、I-FABP水平比較

2.4 各組小鼠小腸組織MDA、SOD水平比較 表3。

表3 各組小鼠小腸組織MDA、SOD水平比較

由表3可見，模型組小鼠小腸組織MDA水平高于假手術(shù)組(P<0.05)，SOD水平低于假手術(shù)組(P<0.05)；林格液組、參附注射液低劑量+林格液組、參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組小鼠小腸組織MDA水平均低于模型組(P<0.05)，SOD水平高于模型組(P<0.05)；參附注射液低劑量+林格液組、參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組小鼠小腸組織MDA水平均低于林格液組(P<0.05)，SOD水平高于林格液組(P<0.05)；參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組小鼠小腸組織MDA水平均低于參附注射液低劑量+林格液組(P<0.05)，SOD水平高于參附注射液低劑量+林格液組(P<0.05)；參附注射液高劑量+林格液組小鼠小腸組織MDA水平低于參附注射液中劑量+林格液組(P<0.05)，SOD水平高于參附注射液中劑量+林格液組(P<0.05)，參附注射液低、中、高劑量+林格液組之間呈劑量依賴性。

2.5 各組小鼠血清IL-1β、IL-6水平比較 見表4。

表4 各組小鼠血清IL-1β、IL-6水平比較

由表4可見，模型組小鼠血清IL-1β、IL-6水平均高于假手術(shù)組(P<0.05)；林格液組、參附注射液低劑量+林格液組、參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組小鼠血清IL-1β、IL-6水平均低于模型組(P<0.05)；參附注射液低劑量+林格液組、參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組小鼠血清IL-1β、IL-6水平均低于林格液組(P<0.05)；參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組小鼠血清IL-1β、IL-6水平均低于參附注射液低劑量+林格液組(P<0.05)，參附注射液高劑量+林格液組小鼠血清IL-1β、IL-6水平均低于參附注射液中劑量+林格液組(P<0.05)，參附注射液低、中、高劑量+林格液組之間呈劑量依賴性。

2.6 各組小鼠小腸組織RANKL/OPG信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 見表5。

表5 各組小鼠小腸組織RANKL/OPG信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

由表5可見，模型組小鼠小腸組織RANKL/OPG信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平均高于假手術(shù)組(P<0.05)；林格液組、參附注射液低劑量+林格液組、參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組小鼠小腸組織RANKL/OPG信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平均低于模型組(P<0.05)；參附注射液低劑量+林格液組、參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組小鼠小腸組織RANKL/OPG信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平均低于林格液組(P<0.05)；參附注射液中劑量+林格液組、參附注射液高劑量+林格液組小鼠小腸組織RANKL/OPG信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平均低于參附注射液低劑量+林格液組(P<0.05)，參附注射液高劑量+林格液組小鼠小腸組織RANKL/OPG信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平均低于參附注射液中劑量+林格液組(P<0.05)，參附注射液低、中、高劑量+林格液組之間呈劑量依賴性。各組小鼠小腸組織RANKL/OPG信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)見圖2。

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：林格液組；D：參附注射液低劑量+林格液組；E：參附注射液中劑量+林格液組；F：參附注射液高劑量+林格液組

3 討論

HS發(fā)生時，機(jī)體器官會因大量失血發(fā)生缺血缺氧損傷，隨后因進(jìn)行復(fù)蘇而使血液再灌注，造成組織器官進(jìn)一步損傷，腸道損傷是HS后的一種主要并發(fā)癥，可引發(fā)全身炎性反應(yīng)綜合征，增加患者死亡率，因此保護(hù)腸屏障功能對改善HS患者預(yù)后至關(guān)重要。缺血再灌注引發(fā)的炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致腸屏障功能損傷的主要致病機(jī)制[13-14]。DAO和I-FABP是腸黏膜組織中的重要蛋白，腸黏膜受損時，可大量進(jìn)入血液中，因而血清DAO、I-FABP水平可作為判斷腸屏障受損程度的標(biāo)志[15-16]。本實(shí)驗(yàn)通過取出小鼠30%的總血容量來建立HS模型，結(jié)果顯示，小鼠大量失血后，可導(dǎo)致小腸黏膜上皮細(xì)胞壞死、數(shù)量減少、間隙增大，絨毛破壞、塌陷，排列紊亂，組織充血、水腫，且有大量炎癥細(xì)胞浸潤，病理損傷嚴(yán)重，Chiu評分、血清DAO、I-FABP、IL-1β、IL-6水平及小腸組織MDA水平升高，SOD水平降低，表明大量失血可誘導(dǎo)促炎因子IL-1β、IL-6水平升高，引發(fā)炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成嚴(yán)重的腸黏膜病理損傷，破壞腸屏障功能，提示HS模型建立成功。

HS屬中醫(yī)學(xué)厥脫陽虛諸證，患者表現(xiàn)出病勢危急、脈細(xì)欲絕、陽氣欲脫、心腎陽虛等癥狀，參附注射液源自明代《校注婦人良方》中的參附湯，具有溫陽、固脫、益氣功效，對陽虛厥脫諸證有較好療效，利用現(xiàn)代藥物提取技術(shù)制成注射液，較傳統(tǒng)湯藥起效更快，臨床中用于HS、急性心力衰竭及心源性猝死等疾病治療，可降低膿毒癥患者氧化應(yīng)激水平，修復(fù)其腸屏障功能[8-9,17]，還能明顯抑制創(chuàng)傷性心臟驟停復(fù)蘇引發(fā)的炎性反應(yīng)，減輕腎細(xì)胞凋亡，改善腎功能[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，林格液單獨(dú)應(yīng)用和參附注射液低、中、高劑量+林格液聯(lián)合應(yīng)用復(fù)蘇HS小鼠，均可減輕腸黏膜病理損傷，降低腸黏膜組織Chiu評分、血清DAO、I-FABP、IL-1β及IL-6水平、小腸組織MDA水平，升高SOD水平，且參附注射液+林格液聯(lián)合應(yīng)用較林格液單獨(dú)應(yīng)用作用更強(qiáng)，并呈劑量依賴性，表明以林格液復(fù)蘇HS小鼠，可降低促炎因子表達(dá)，抑制炎癥，減弱氧化應(yīng)激，保護(hù)腸屏障；在林格液應(yīng)用的基礎(chǔ)上聯(lián)合參附注射液復(fù)蘇HS小鼠，可進(jìn)一步減弱炎癥及氧化應(yīng)激損傷，提高腸屏障保護(hù)功能，并隨參附注射液劑量升高而作用增強(qiáng)。

RANKL/OPG是骨代謝領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)信號，參與介導(dǎo)炎性反應(yīng)的發(fā)生及進(jìn)展，在各種炎性疾病中的調(diào)控作用受到越來越多的關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)，RANKL/OPG信號在炎性腸道疾病中處于激活狀態(tài)，HS可上調(diào)該通路蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)炎癥因子IL-6大量合成釋放，引發(fā)炎癥發(fā)生并進(jìn)展，延緩骨折愈合[7,19-20]，但參附注射液對HS小鼠RANKL/OPG通路影響目前還未知。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HS小鼠小腸組織中RANKL及OPG蛋白表達(dá)水平明顯升高，林格液單獨(dú)應(yīng)用和參附注射液低、中、高劑量+林格液應(yīng)用處理HS小鼠，均可降低小腸組織RANKL及OPG蛋白表達(dá)水平，且參附注射液+林格液應(yīng)用較林格液單獨(dú)應(yīng)用作用更強(qiáng)，并呈劑量依賴性，表明RANKL/OPG信號參與調(diào)控HS后腸屏障損傷過程，參附注射液可抑制RANKL/OPG信號通路激活，保護(hù)腸屏障功能。

綜上所述，參附注射液可下調(diào)HS小鼠小腸組織RANKL、OPG蛋白表達(dá)，抑制炎性反應(yīng)發(fā)生，降低氧化應(yīng)激水平，減輕腸黏膜損傷，促使其屏障功能恢復(fù)，阻滯RANKL/OPG信號傳導(dǎo)可能是其藥理機(jī)制。本研究進(jìn)一步證實(shí)了參附注射液可減輕HS引發(fā)的腸屏障功能損傷，并對其藥理機(jī)制進(jìn)行了初步探討，后續(xù)還應(yīng)對激活并抑制RANKL/OPG信號進(jìn)行對照驗(yàn)證，以探索更確切的作用機(jī)制。