牙髓血運重建術對年輕恒牙根部組織VEGF、NGF表達的影響

劉迪 史濱偉 陶冠男

近些年來臨床上運用牙髓血液重建方法實現牙髓再生的病例多有報道[1-4]。牙髓血運重建術是治療口腔疾病的一種新方法，不但對感染及壞死牙髓具有修復作用，而且能促使牙本質再生。干細胞、支架和生長因子分析以及發(fā)展適宜的環(huán)境，都對牙髓的再生過程起到不可或缺的重要作用。大量的體內外實驗證明，生長因子能有效促進血管生成[5-6]，誘導根尖形成，但在實際的牙髓血運重建過程中，這些生長因子會有怎樣的變化規(guī)律尚不清楚。本研究方法將對大鼠可以進行保護牙髓血運重建，建立動物學模型，觀察年輕恒牙根組織牙髓再生過程中的神經細胞生長因子（nerve growth factor，NGF）和血管內皮細胞生長因子（vascular endosthort growth factor，VEGF）的表達能力情況，為牙髓血運重建后大鼠牙周組織的炎癥吸收和愈合機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器和實驗動物

三氧化物凝聚體（mineral trioxide aggregate，MTA）（登士柏公司，美國）；玻璃離子水門汀（glass-ionomer cement，GIC）；口腔顯微鏡（萊卡公司，德國）；RNA逆轉錄試劑（武漢博士德生物公司，中國）；SD大鼠（哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物學部）。

1.2 研究方法

選取20只3.5周齡SPF級SD大鼠，體質量60～80 g，雌雄比例各半。隨機取其中10只作為實驗組。另外10只不作任何處理，以下頜第一磨牙為對照組。

麻醉劑采用戊巴比妥鈉，腹腔注射。待翻正反射消失后，將SD大鼠固定于鼠板上，用口腔牽拉裝置調節(jié)大鼠口腔角度，根據手術操作需要使其充分暴露口腔術區(qū)及下頜磨牙區(qū)。

對SD大鼠下頜第一磨牙進行牙髓血運重建：首先對作業(yè)術野進行消毒，用棉卷進行隔濕，保持整個過程無菌。用高速不銹鋼球鉆（＃1 / 4）將大鼠下頜第一磨牙的冠部開髓，用生理鹽水沖洗根管腔，然后將手動不銹鋼擴張針（30）插入根尖孔，使根尖周組織盡可能多地出血，并盡可能多地用血液填充根管。待牙頸部充滿中國血液時，將無菌小棉球蘸濕生理進行鹽水后輕微擠干，放置在根管口3～4 mm下；約10 min后，基本形成具有血凝塊，取出小棉球，然后用MTA覆蓋整個血凝塊表面。最后使用玻璃離子水門汀（GIC）對其冠部進行填充，表面涂布凡士林。填充后，用探針探測填充邊緣，確認填充穩(wěn)定。術后正常喂食飲水，定期觀察牙冠封閉情況和大鼠健康狀況，如果發(fā)現填充體脫落，重新進行填充。

術后3周將20只大鼠處死，5只實驗組與5只對照組進行分離下頜骨以及對照，進一步進行組織學觀察和影像學觀察。另外5只實驗組與5只對照組進行VEGF和NGF的熒光光定量qRT－PCR的檢測。

1.3 觀察指標

1.3.1 影像學觀察 戊巴比妥鈉麻醉，4%多聚甲醛行心臟灌注。灌注后解剖取出下頜骨，放置于4%中性多聚甲醛中，固定24 h后，分別標記各個標本。標記后，通過X射線成像系統(tǒng)對樣本進行掃描和成像。

1.3.2 組織學觀察 戊巴比妥鈉麻醉，4%多聚甲醛行心臟灌注。灌注后解剖分離下頜骨，將多余的硬組織和骨表面軟組織去除后，先放置于15%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），脫鈣在EDTA作用后2個月內進行，然后置于常規(guī)乙醇中脫水。石蠟包埋后，通過根尖孔沿牙齒長軸（切片厚度4μm）制作切片。

蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色觀察：實驗組和對照組分別取石蠟切片。在68℃～70℃烘烤30分鐘后，脫蠟入水中，HE染色；然后，兩名具有相同標準（Kappa=0.804）的測試人員在光學顯微鏡下觀察每個牙根的組織切片，并根據以下參數和組織學類型進行評估。

參數分別為：（1）是否在管腔及根尖周圍環(huán)境存在大量的炎癥反應細胞；（2）是否在牙根牙本質內壁上有新生硬組織；（3）是否在根尖有硬組織沉積，令牙根長度可以增加；（4）根尖是否能夠存在一個閉合的趨勢；（5）是否在根管內存在一些新生的組織。

1.3.3 qRT－PCR檢測 戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，多聚甲醛心臟灌注之前，在每一側下頜骨的根管內組織及根尖周組織，收集到1個去RNA酶的微型離心管（eppendorf，EP）管，待降溫后，將其放入液氮中，并儲存在-80℃的冰箱中。提取組織總RNA，進行qRT－PCR檢測mRNA表達，每個樣本有3個平行復孔。

1.4 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 24.0軟件和GraphPad Prism 8軟件對上述檢測結果進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用獨立樣本t檢驗，比較實驗組與對照組間是否存在差異，α=0.05為檢驗水準，當P＜0.05時，差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 影像學觀察結果

X光片結果顯示，實驗組下頜第一磨牙根尖陰影增大，管壁增厚，形成一定數量的新的高密度硬組織，牙根仍發(fā)育。對照組大鼠下頜第一磨牙牙體完整，根尖周圍未發(fā)現存在明顯異常，牙根沒有在系統(tǒng)發(fā)育過程中完成，根管口成喇叭狀。

2.2 HE染色結果

HE染色結果顯示，實驗組大鼠下頜第一磨牙管腔及根管存在炎性細胞，牙根本質內壁上有新生硬組織生成，根尖有組織沉積，牙根長度增加，發(fā)生改變。根管內存在大量新生的組織，并且根尖有進一步閉合的趨勢，牙根繼續(xù)發(fā)育。對照組大鼠下頜第一磨牙管腔及根管不存在炎性細胞，牙髓為疏松結締組織，位于牙本質組成的髓腔內，根尖呈現尚未完全閉合狀態(tài)。

2.3 qRT-PCR檢測結果

qRT-PCR檢測結果顯示，實驗組VEGF的mRNA的表達比對照組高很多，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001 7＜0.05）；實驗組NGF的mRNA的表達高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.039 7＜0.05）。如圖1所示。

圖1 qRT-PCR檢測VEGF與NGF相對表達量結果示意圖

3 討論

近年來對血管內皮細胞生長因子（vascular endosthort growth factor，VEGF）的研究較多，它是1989年分離純化出來的一類糖蛋白。是重要的血管源性生長因子，具有兩大突出的生物學特性：一方面，它可顯著增加血管通透性，是目前己知最強的血管通透性因子之一[7]。另一方面，它是一種強大的血管生成誘導劑，在炎癥及創(chuàng)傷愈合過程中，可激活內皮細胞誘導新生血管形成[8]。有研究[9]顯示VEGF在多種組織的損傷后修復過程中起作用。本實驗中，血運重建術后大鼠牙髓根部的VEGF的qRT-PCR結果顯示，VEGF的相對表達量顯著高于對照組，且差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001 7＜0.05）。結合影像學與組織學觀察結果，提示牙髓血管通透性的增加和炎性細胞的積聚是由VEGF產物的上調引起的。該產品還可以增加牙髓血運重建過程中的血管內壓力，加速炎癥的發(fā)展。同時，VEGF產物可以保證了牙髓細胞組織血供充足，增加了患者血管通透性，益于組織進行修復。鑒于損傷愈合的2大典型特征：血管通透性增加和血管生成都因VEGF產物上調而出現，因此VEGF在牙髓血運重建過程中起到重要作用。

神經細胞生長因子（nerve growth factor，NGF）是一種多功能生長因子，促進中樞神經和周圍神經的發(fā)育、分化和生長，其功能不斷地被學者們深入探討研究[10]。越來越多的學者通過研究NGF在不同的組織、器官（如大腦[11]、肝臟[12]、坐骨神經[13]、皮膚[14]等）中的作用發(fā)現，其與組織炎癥的發(fā)生和損傷時伴發(fā)的痛覺過敏密切相關。本實驗中，血運重建術后大鼠牙髓根部的NGF的qRT-PCR結果顯示，NGF的相對表達量高于對照組，且差異有統(tǒng)計學意義（P=0.039 7＜0.05）。說明NGF參與牙髓血運重建的調控，在牙齒受到損傷或炎癥感染后牙髓組織中NGF表達水平升高，牙髓局部NGF濃度的升高不僅可以促進牙髓損傷處感覺神經纖維再生，還可導致痛覺過敏的產生，刺激牙髓細胞分化為牙本質，促進礦化形成[15]；NGF本身也可促進牙髓細胞的增殖和向成牙本質細胞分化[16]。

綜上所述，本實驗通過建立大鼠下頜第一磨牙牙髓血運重建模型，利用影像學、組織學及qRT-PCR等方法對實驗結果進行了評價，結果表明，在年輕恒牙牙髓血運重建過程中，其根部組織VEGF、NGF的mRNA相對表達量明顯增加。