響應面法優化超聲輔助提取肉豆蔻總黃酮工藝及其抗氧化活性研究

卓微偉，李鳳，胡君

（江蘇醫藥職業學院，江蘇 鹽城 224005）

肉豆蔻（Myristica fragrans Houtt.）是肉豆蔻科肉豆蔻屬植物的成熟種仁，可除異味、增辛香，常作為調味料用于肉品的鹵制和醬肉的加工中[1]。同時，肉豆蔻也是我國常用的中藥材之一，其生理功能包括抑菌、抗癌、降血糖、抗衰老、保護肝臟等，而這些生理功能都與肉豆蔻含有的多種抗氧化活性物質有關[2-3]。

黃酮類化合物主要是指具有2-苯基色原酮結構的化合物，是一種多酚類植物次級代謝產物，因其具有多種較好的生理功能而備受關注[4-5]。黃酮類化合物的提取方式主要包括堿溶酸沉法、超聲輔助提取法、酶解法等，其中超聲輔助提取法是通過超聲波產生的機械破碎作用、空化效應以及熱效應破壞細胞結構，進而加快細胞內含物釋放的一種提取技術，具有提取率高、耗時少、提取物結構不易被破壞等優點，被廣泛運用于黃酮類化合物的提取中[6-8]。目前，國內外對于肉豆蔻的研究主要集中在對其揮發油[9]、木脂素[10]、多酚[11]等的提取及成分分析，關于肉豆蔻中總黃酮的提取及抗氧化活性的研究卻鮮有報道。

本研究擬采用超聲輔助法對肉豆蔻總黃酮進行提取，并以總黃酮得率為評價指標，利用單因素試驗和響應面試驗確定提取工藝的最佳參數。最后利用Fenton反應法、鄰苯三酚自氧化法和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼比色法分別評價肉豆蔻總黃酮對羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）和 DPPH 自由基的清除能力，以期為肉豆蔻的多方向利用和功能活性的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉豆蔻：市售，4℃保藏備用。

蘆丁標準品：蘇州天可貿易有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁：鄒平天鹿化工有限公司；無水乙醇、水楊酸、硫酸亞鐵、鹽酸、鄰苯三酚、氫氧化鈉、無水碳酸鈉（均為分析純）：天津市德恩化學試劑有限公司；過氧化氫、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（均為分析純）：洛陽昊華化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

電子天平（FA2004B型）：上海精密科學儀器有限公司；真空干燥箱（DZF-6020型）：南京優豐干燥設備有限公司；高速多功能粉碎機（DFY-400C型）：溫嶺市林大機械有限公司；紫外分光光度計（756PC型）：湖南力辰儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的制作

參考陳蘇丹等[12]的方法，準確稱取10 mg蘆丁標準品，用70%乙醇溶解并定容至100 mL，得質量濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標準溶液。依次吸取上述標準液0、1、2、3、4、5 mL 于試管中，向其中加入 5%NaNO2溶液及10%Al（NO3）3溶液各0.5 mL，搖勻后反應6 min，隨后加入4%NaOH溶液4 mL，混合均勻，并用70%乙醇定容至10 mL，在25℃下靜置15 min后，于510 nm處測定吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標制作蘆丁標準曲線，所得標準曲線方程為y=0.180 2x-0.054 1（R2=0.974 7）。

1.3.2 肉豆蔻總黃酮提取及含量測定

精密稱取10 g經干燥粉碎后的肉豆蔻粉末，按一定的乙醇濃度、超聲溫度、超聲時間、料液比進行提取，抽濾后得到肉豆蔻總黃酮提取液，按標準曲線相同操作測定肉豆蔻總黃酮的吸光度，利用標準曲線方程計算出提取液中總黃酮的濃度，并利用下面公式計算肉豆蔻總黃酮的得率。

W/%=C×V/M×100

式中：W為肉豆蔻總黃酮得率，%；C為總黃酮的濃度，mg/mL；V為濾液體積，mL；M為肉豆蔻質量，mg。

1.3.3 單因素試驗

以總黃酮得率為指標，采用控制變量法考察乙醇濃度（50%、60%、70%、80%、90%）、超聲溫度（60、70、80、90、100 ℃）、超聲時間（20、30、40、50、60 min）和料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）]對肉豆蔻總黃酮得率的影響。

1.3.4 響應面試驗設計

以單因素試驗為基礎，以肉豆蔻總黃酮得率為響應值，利用Design-Expert 8.0.6.1軟件設計四因素三水平響應面試驗，優化肉豆蔻總黃酮提取工藝，試驗因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.3.5 抗氧化活性試驗

分別配制濃度為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 的肉豆蔻總黃酮提取液，以相同濃度的VC作為陽性對照，采用Fenton反應法[13]、鄰苯三酚自氧化法[14]和DPPH比色法[15]測定其對·OH、O2-·和DPPH 自由基的清除率，從而評價肉豆蔻總黃酮的抗氧化活性。

1.4 數據分析

采用Office2010對所得數據進行處理，利用Design-Expert 8.0.6.1軟件進行響應面分析，每組試驗重復3次并取平均值。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度對肉豆蔻總黃酮得率的影響

選取乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%，分析乙醇濃度對肉豆蔻總黃酮得率的影響，結果如圖1所示。

圖1 乙醇濃度對肉豆蔻總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of total flavonoids from nutmeg

由圖1可知，肉豆蔻總黃酮得率隨著乙醇濃度的升高先增大后緩慢減小，且當乙醇濃度為80%時，肉豆蔻總黃酮的得率最高。這是由于總黃酮類物質的溶出與提取溶劑的極性有關，隨著乙醇濃度的升高，肉豆蔻總黃酮與乙醇的極性逐漸接近，總黃酮類物質溶出增多。但是乙醇濃度過高，溶劑極性減小，阻礙了部分黃酮苷的溶解，并且造成其它醇溶性雜質及色素等物質的大量溶出，從而加速了其它物質與總黃酮類物質的溶出競爭[16]，總黃酮得率有所下降。因此乙醇的最適濃度為80%。

2.1.2 超聲溫度對肉豆蔻總黃酮得率的影響

選取超聲溫度為 60、70、80、90、100 ℃，分析超聲溫度對肉豆蔻總黃酮得率的影響，結果如圖2所示。

圖2 超聲溫度對肉豆蔻總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on the extraction yield of total flavonoids from nutmeg

由圖2可知，隨著超聲溫度的增加，肉豆蔻總黃酮得率先增大后減小，且當超聲溫度為80℃時，總黃酮得率最高。這是因為溫度的升高加快了分子間的運動，總黃酮類物質在提取溶劑中的擴散、溶解能力增強，溶出量增多。然而溫度過高時，提取溶劑揮發加劇，乙醇濃度降低，影響提取效果。此外，過高的溫度容易破壞總黃酮物質結構，同時加速了黃酮醇類等物質的分解速率及其它黃酮類化合物的氧化、縮合、降解等反應[17-18]，總黃酮得率下降。因此最佳超聲溫度為80℃。

2.1.3 超聲時間對肉豆蔻總黃酮得率的影響

選取超聲時間為 20、30、40、50、60 min，分析超聲時間對肉豆蔻總黃酮得率的影響，結果如圖3所示。

圖3 超聲時間對肉豆蔻總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the extraction yield of total flavonoids from nutmeg

由圖3可知，肉豆蔻總黃酮的得率隨著超聲時間的延長先增大后減小，且當超聲時間為50 min時，總黃酮得率最高。這可能是黃酮類化合物大多存在于肉豆蔻的細胞膜中，在超聲波的作用下，植物細胞結構被破壞，分子運動速率加快，總黃酮類物質不斷溶出，總黃酮得率增加[19]。但是超聲時間過長，其產生的機械作用和空化效應會對總黃酮結構造成一定程度的破壞，從而導致總黃酮得率下降[20]。因此，超聲時間以50 min為宜。

2.1.4 料液比對肉豆蔻總黃酮得率的影響

選取料液比為 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 （g/mL），分析料液比對肉豆蔻總黃酮得率的影響，結果如圖4所示。

圖4 料液比對肉豆蔻總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of total flavonoids from nutmeg

由圖4可知，隨著溶劑用量的增加，肉豆蔻總黃酮的得率逐漸增加，且當料液比為1∶40（g/mL）時達到最高，之后逐漸趨于穩定。這是由于增大溶劑用量，肉豆蔻粉末與提取溶劑能夠充分接觸，有利于總黃酮類物質從肉豆蔻內部向溶劑中擴散，總黃酮得率提高。但是當料液比達到一定程度時，總黃酮類物質已基本溶出，此時若繼續增加溶劑用量，不僅容易造成雜質的溶解，還會增加溶劑成本[21]。因此，最佳的料液比為1∶40（g/mL）。

2.2 響應面優化結果與分析

2.2.1 響應面優化試驗結果

結合單因素試驗結果，以肉豆蔻總黃酮得率為響應值，利用響應面試驗對肉豆蔻總黃酮的提取工藝進行優化，其試驗設計與結果如表2所示，在此基礎上進一步對回歸模型進行方差分析，結果如表3所示。

表2 響應面試驗結果Table 2 Response surface test results

續表2 響應面試驗結果Continue table 2 Response surface test results

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

使用響應面分析軟件對表2試驗數據進行回歸擬合，得到以總黃酮得率為響應值的回歸方程：Y=2.43-0.097A+0.085B+0.054C-0.022D-0.015AB+0.042AC+0.52AD+0.24BC-0.18BD+0.26CD-0.25A2-0.59B2-0.25C2-0.50D2。

由表3可知，模型極顯著（P<0.01），失擬項不顯著（P>0.05），說明該模型誤差小。R2值為 0.952 7，R2adj值為0.905 5，CV為7.69%，說明模型擬合度良好，進一步說明該模型的可靠性，并可將其用于肉豆蔻總黃酮得率的預測和分析。顯著性分析檢驗結果顯示，AD、BC、CD、A2、B2、C2、D2項對總黃酮得率均有極顯著影響，A、B、BD 項對肉豆蔻總黃酮得率影響顯著，C、D、AB、AC項對肉豆蔻總黃酮得率影響不顯著。根據F值可知，4個因素對肉豆蔻總黃酮得率的影響順序為乙醇濃度（A）>超聲溫度（B）>超聲時間（C）>料液比（D）。

2.2.2 各因素交互作用的響應面圖分析

為考察各因素交互作用對肉豆蔻總黃酮得率的影響，通過Design-Expert 8.0.6.1軟件繪制相應的響應面圖，結果如圖5所示。

圖5 各因素交互作用對肉豆蔻總黃酮得率影響的響應面圖Fig.5 Response surface plot of the influence of the interaction of various factors on the extraction yield of total flavonoids from nutmeg

響應曲面的陡峭程度可以反映各因素值的變化對于響應值的影響大小。由圖5可知，交互項AD（圖5c）、CD（圖 5f）、BC（圖 5d）和 BD（圖 5e）的響應曲面坡度較為陡峭，且等高線呈橢圓形或馬鞍形，說明乙醇濃度與料液比、超聲時間與料液比、超聲溫度與超聲時間、超聲溫度與料液比的交互作用均顯著，對肉豆蔻總黃酮得率的影響較大；而其它項的響應曲面圖坡度較平緩，表明其交互作用不顯著，這與表3中回歸方程的方差分析結果一致。

2.2.3 驗證性試驗

根據響應面回歸模型預測可得肉豆蔻總黃酮的最佳提取工藝參數為乙醇濃度73.73%，超聲溫度81.25℃，超聲時間 49.11 min，料液比 1∶36.03（g/mL），此時肉豆蔻總黃酮得率預測值為2.466%。為方便試驗操作，確定其最終提取工藝條件為乙醇濃度74%，超聲溫度81 ℃，超聲時間 49 min，料液比 1∶36（g/mL），并在此最優組合下進行3次平行驗證試驗，得到肉豆蔻總黃酮得率平均值為2.503%，與預測值相近，進一步證明了該模型的可信性。

2.3 肉豆蔻總黃酮的抗氧化活性

2.3.1 肉豆蔻總黃酮對·OH的清除作用

以VC為陽性對照，肉豆蔻總黃酮對·OH的清除率結果如圖6所示。

圖6 肉豆蔻總黃酮對·OH的清除率Fig.6 Scavenging rate of total flavonoids from nutmeg for·OH

由圖6可知，肉豆蔻總黃酮對·OH的清除率隨著其濃度的增加呈上升趨勢，當肉豆蔻總黃酮濃度達到0.5 mg/mL時，其對·OH的清除率為85.78%，略低于同濃度下的VC對·OH的清除能力。這是由于黃酮化合物含有具備供氫及供電子能力的酚羥基、C4酮羰基等結構，其提供的氫原子能與·OH結合，終止自由基的氧化損傷反應，從而達到清除·OH的效果[22]。

2.3.2 肉豆蔻總黃酮對O2-·的清除作用

O2-·活潑性較強，與機體的氧化損傷有著密切的聯系，是評價抗氧化活性的一項重要指標。不同濃度的肉豆蔻總黃酮與VC對O2-·清除率的測定結果如圖7所示。

圖7 肉豆蔻總黃酮對O2-·的清除率Fig.7 Scavenging rate of total flavonoids from nutmeg for O2-·

由圖7可知，隨著肉豆蔻總黃酮濃度的增加，其對O2-·的清除率也不斷增加，且0.5 mg/mL的肉豆蔻總黃酮對O2-·的清除率為88.31%，與同濃度的VC相比，其清除能力略低。然而由于VC本身是一種強氧化劑，因此可認定肉豆蔻總黃酮具有較好的清除O2-·的能力。

2.3.3 肉豆蔻總黃酮對DPPH自由基的清除作用

不同濃度的肉豆蔻總黃酮和VC對DPPH自由基的清除率結果如圖8所示。

圖8 肉豆蔻總黃酮對DPPH自由基的清除率Fig.8 Scavenging rate of total flavonoids from nutmeg for DPPH free radical

由圖8可知，肉豆蔻總黃酮對DPPH自由基的清除率隨著其濃度的升高而不斷增加，且0.5 mg/mL的肉豆蔻總黃酮對DPPH自由基的清除率為92.31%，與等濃度的VC對DPPH自由基的清除能力相近，可見肉豆蔻總黃酮對DPPH自由基具有較強的清除能力。

3 結論

本研究探討了肉豆蔻總黃酮的最佳超聲輔助提取工藝參數及其抗氧化活性。結果表明，肉豆蔻總黃酮的最佳提取工藝參數為乙醇濃度74%、超聲溫度81 ℃、超聲時間 49 min、料液比 1∶36（g/mL），在此工藝條件下，肉豆蔻總黃酮的得率為2.503%。此外，抗氧化試驗結果顯示，0.5 mg/mL的肉豆蔻總黃酮對·OH、O2-·和DPPH自由基的清除率分別為85.78%、88.31%和92.31%，略低于同濃度的VC的抗氧化能力，但仍表現出較好的抗氧化活性。然而本試驗也有不足之處，如試驗得到的肉豆蔻總黃酮僅為粗提物，還需進一步的純化才能發揮更好的功效，提取物中具體的組成成分及其它的功能活性也需深入研究。