黃藥葉總黃酮提取工藝優化及其抗氧化活性研究

桂利利，吳正坤，余惠凡，李飛

（1.湖北醫藥學院藥學院武當特色中藥研究湖北省重點實驗室，湖北 十堰 442000；2.湖北醫藥學院生物醫藥研究院，湖北 十堰 442000）

黃藥（Premna cavaleriei Levl.）是馬鞭草科豆腐柴屬植物[1]，湖北省十堰市武當山地區野生黃藥分布廣、品質優，當地居民有用黃藥葉制作“神仙豆腐”的傳統，但多以農家自制為主，缺乏系統化和標準化開發。目前尚無黃藥的相關研究報道，而相對報道較多的為黃藥同屬植物。研究表明，該屬植物的葉中含有黃酮、果膠、揮發油、氨基酸、維生素、多糖和礦物質等多種營養成分[2-3]，其中黃酮類化合物具有抗氧化、抗菌、抗病毒、防治心腦血管疾病及降血脂等功效，應用范圍廣[4-6]。因此，深入研究黃藥葉黃酮成分、提取工藝等可為當地黃藥葉質量標準制定與產品開發提供理論依據。

本文以總黃酮得率為檢測指標，乙醇為提取溶劑，選用L9（34）正交試驗，優化黃藥葉總黃酮超聲波輔助提取工藝，并通過測定羥自由基清除率、DPPH自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率和鐵離子還原能力考察其體外抗氧化活性。本研究彌補了黃藥研究的空白，為明確其有效成分奠定基礎，并為黃藥藥食同源相關產品開發利用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃藥葉原料：2019年9月采于十堰市張灣區黃龍鎮青石村，經湖北醫藥學院附屬十堰市人民醫院中藥學專家張曉燕副教授鑒定為馬鞭草科豆腐柴屬植物黃藥（Premna cavaleriei Levl.）的葉；蘆丁標準品：上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉、鄰苯三酚、水楊酸、氯化鐵、亞硝酸鈉、硝酸鋁、L-抗壞血酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；30%過氧化氫（優級純）：德國Merck公司；鹽酸（分析純）：上海安譜實驗科技股份有限公司；DPPH、三羥甲基氨基甲烷（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；2，4，6-三吡啶基三嗪（2，4，6-tripyridyl-triazine，TPTZ）（分析純）：阿拉丁試劑有限公司；試驗用水均為超純水。

TU-1901型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；KQ-250DE型超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；MBF-20A型高速中藥粉碎機：溫嶺市邁邦機械設備有限公司；CPA225D型電子天平、PB-10型酸度計：德國Sartorius公司；RE-52AA型旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；SH2-D（Ⅲ）型循環水式真空泵：河南省予華儀器有限公司；GZX-9240MBE型電熱鼓風干燥箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃藥葉樣品制備

新鮮黃藥葉，采摘當天用純水洗凈，50℃烘干，粉碎過60目篩，得黃藥葉粉末，密封備用。

1.2.2 超聲波輔助提取法提取黃藥葉總黃酮

1.2.2.1 單因素試驗

精密稱取1.2.1項下樣品2.000 g，確定料液比1∶20（g/mL），60%乙醇溶液，浸泡時間 30 min，提取溫度55℃，超聲功率125 W，提取時間30 min，提取次數1次為固定因子，分別考察提取溫度（25、35、45、55、65、75 ℃）、料液比[1∶7.5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL）]、乙醇體積分數（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）、浸泡時間（0、10、20、30、40、50，60 min）、超聲功率（100、125、150、175、200、225、250 W）、提取時間（0、10、20、30、40、50、60 min） 和提取次數（1、2、3、4、5次）對超聲波輔助提取黃藥葉總黃酮得率的影響。

1.2.2.2 正交試驗

在單因素試驗結果基礎上，選擇對總黃酮得率影響較大的4個因素，進行四因素三水平正交試驗，因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.3 樣品提取液中總黃酮含量及得率測定

1.2.3.1 對照品溶液的配制

精密稱取蘆丁對照品20.0 mg，加無水乙醇定容至50 mL，備用。

1.2.3.2 標準曲線的繪制

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉光度法測定樣品總黃酮含量[7]。精密吸取對照品溶液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于 25 mL 容量瓶中，加無水乙醇至6.0 mL，再分別加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加入10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加入1 mol/L氫氧化鈉溶液10 mL，搖勻，最后加入30%乙醇至刻度，放置15 min。510 nm波長處測定吸光度值，以吸光度值（A）為縱坐標、蘆丁質量濃度（mg/mL）為橫坐標繪制標準曲線Y=0.013 76X-0.001 04，R2=0.999 9，結果表明蘆丁對照品在0～0.08 mg/mL范圍內線性關系良好。

1.2.3.3 樣品提取液中總黃酮含量及得率測定

依據1.2.2項下方法提取樣品，離心取上清，并用60%乙醇溶液定容至100 mL，精密吸取1.0mL至25mL容量瓶，待測，以等體積無水乙醇為對照，按1.2.3.2項下試驗步驟進行總黃酮含量測定。由公式（1）計算總黃酮得率。

式中：c為根據標準曲線方程計算出樣品中總黃酮含量，mg/mL；N為稀釋倍數；V為樣品提取液總體積，mL；m 為樣品質量，g。

1.2.4 黃藥葉總黃酮提取物抗氧化性能測定

1.2.4.1 羥自由基清除率測定

參考李亞軍等[8]和Liang等[9]的方法略作改動。在最優工藝條件下提取黃藥葉總黃酮，并用提取溶劑（即80%乙醇溶液）將提取液稀釋成濃度為50、100、200、300、400 μg/mL的黃藥葉總黃酮溶液，取樣品液1.0 mL于具塞刻度試管中，再加9 mmol/L FeSO41 mL，反應15 min后加9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL，最后加 8.8 mmol/L H2O21 mL，37℃反應 30 min，測510 nm處吸光度值，記A1；用蒸餾水代替H2O2測定樣品的本底吸光度值，記A2；以蒸餾水代替樣品，記A0；用提取溶劑溶解陽性對照物L-抗壞血酸，并配制為上述濃度梯度的溶液，同法測定其羥自由基清除率。由公式（2）計算清除率。

1.2.4.2 DPPH自由基清除率測定

參考 Yeo等[10]和 GB/T 39100—2020《多肽抗氧化性測定DPPH和ABTS法》[11]的方法略有改動。同1.2.4.1 方法，稀釋提取液得到濃度為 2、4、6、8、10、20、40 μg/mL的黃藥葉總黃酮溶液，取樣品液2.0 mL于具塞刻度試管中，再依次加2 mL的DPPH試劑（0.2 mmol/L），暗反應30 min，離心后取上清液作為試驗組，于517 nm處測吸光度值，記A1；用2.0 mL甲醇代替2.0 mL DPPH，測定樣品的本底吸光度值，記A2；用蒸餾水代替樣品作空白對照，記A0；用提取溶劑溶解陽性對照物L-抗壞血酸，并配制為上述濃度梯度的溶液，同法測定其DPPH自由基清除率。由公式（3）計算清除率。

1.2.4.3 超氧陰離子自由基清除率測定

參考Tao等[12]的方法略有改動。同1.2.4.1方法，稀釋提取液得到濃度為 10、20、30、40、50 μg/mL 的黃藥葉總黃酮溶液，取樣品液1.0 mL于具塞刻度試管中，再分別加 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.2）3 mL，37℃水浴20 min，立即加37℃預熱的7 mmol/L鄰苯三酚1 mL，迅速搖勻倒入比色皿，325 nm處每30 s測吸光度值，連測4 min，計算每分鐘變化值，記A1；蒸餾水代替樣品，增加值記A0；用提取溶劑溶解陽性對照物L-抗壞血酸，并配制為上述濃度梯度的溶液，同法測定其超氧陰離子自由基清除率。由公式（4）計算清除率。

1.2.4.4 鐵離子還原能力測定

參考王國慶等[13]的方法略有改動。配制TPTZ工作液：將 0.3 mol/L 醋酸緩沖液（pH 3.6）、10 mmol/L TPTZ溶液（溶于40 mmol/L鹽酸）、20 mmol/L氯化鐵溶液以10∶1∶1 體積比混合，現配現用。

同1.2.4.1方法，稀釋提取液得到濃度為25、50、100、200、300、400 μg/mL 的黃藥葉總黃酮溶液。試驗組加入200 μL同濃度樣品和1.8 mL TPTZ工作液，空白組加入200 μL蒸餾水與1.8 mL TPTZ工作液，對照組加入200 μL不同濃度樣品和1.8 mL蒸餾水。避光靜置10 min，593 nm處測吸光度，空白組吸光度值為A0，試驗組吸光度值為A1，對照組吸光度值為A2。用提取溶劑溶解陽性對照物L-抗壞血酸，并配制為上述濃度梯度的溶液，同法測定其鐵離子還原能力。吸光度越大表示還原能力越強。由公式（5）計算鐵離子還原能力。

1.3 數據處理

所有試驗均設3個平行，試驗數據以平均值±標準差表示，采用SPSS 19.0統計軟件進行單因素方差分析、GraphPad Prism 8.0進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 超聲波輔助提取法單因素試驗

2.1.1 提取溫度單因素試驗結果

提取溫度對黃藥葉總黃酮得率的影響見圖1。

圖1 提取溫度對黃藥葉總黃酮得率的影響Fig.1 Extraction temperature on the yield of total flavonoids in Premna cavaleriei Levl.leaves

由圖1可知，提取溫度在25℃～55℃時，總黃酮得率呈先下降后升高趨勢，在55℃時，達到峰值4.08%，繼續升溫至65℃以上時，總黃酮得率有所降低。溫度升高可加劇分子熱運動，降低溶劑黏度，總黃酮在溶劑中溶解速度加快，得率上升[14-15]；但溫度過高可能會加快溶劑揮發和總黃酮氧化分解，導致得率下降[16]。因此，55℃為最佳提取溫度。

2.1.2 料液比單因素試驗結果

料液比對黃藥葉總黃酮得率的影響見圖2。

圖2 料液比對黃藥葉總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of solid/liquid ratio on the yield of total flavonoids in Premna cavaleriei Levl.leaves

由圖 2 可知，料液比在 1∶7.5（g/mL）～1∶30（g/mL）時，隨著溶劑體積的增大，總黃酮得率呈遞增趨勢，料液比為1∶30（g/mL）時總黃酮得率達到最大值3.99%后趨于平衡。原因可能是隨著溶劑量的加大，樣品與溶劑的接觸面積也逐漸增大，在料液比1∶30（g/mL）時溶劑充分包裹樣品，再繼續增加溶劑量，對總黃酮得率將無促進作用[17]。此外，隨溶劑量增大，細胞內非黃酮類雜質溶出量增加，阻礙了總黃酮溶出，導致得率下降[18]。為獲取最佳料液比，選取 1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）作為正交試驗設計中料液比的3個水平。

2.1.3 乙醇體積分數單因素試驗結果

乙醇體積分數對黃藥葉總黃酮得率的影響見圖3。

圖3 乙醇體積分數對黃藥葉總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids in Premna cavaleriei Levl.leaves

由圖3可知，當乙醇體積分數為60%時，黃藥葉總黃酮得率最高，為3.47%，但隨著乙醇體積分數繼續增大，總黃酮得率呈下降趨勢。可能因60%乙醇溶液極性與黃藥葉中黃酮類化合物的極性較為相近，依據相似相溶原理，得率較高，但當乙醇體積分數高于60%時，提取溶劑與黃酮類化合物之間極性差異增大，導致總黃酮得率呈下降趨勢[19]。另外，隨著乙醇體積分數的增大，更多的蛋白質、糖類和脂溶性雜質溶出，導致總黃酮得率有所下降[20-21]。因此，選擇50%、60%和70%作為正交試驗設計乙醇體積分數的3個水平。

2.1.4 浸泡時間單因素試驗結果

浸泡時間對黃藥葉總黃酮得率的影響見圖4。

圖4 浸泡時間對黃藥葉總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of soaking time the yield of total flavonoids in Premna cavaleriei Levl.leaves

由圖4可知，當浸泡時間為10 min時，黃藥葉總黃酮得率最高，為2.98%。浸泡時間增加至20 min時，總黃酮得率有所下降，隨著浸泡時間的進一步延長，總黃酮得率基本穩定。可能是因為初始階段提取溶劑迅速包裹樣品，提取液中黃酮類化合物含量提高[22]，但隨著浸泡時間的增加，樣品在提取液中逐漸沉降[23]，導致提取液中有效成分減少。因此，浸泡時間10 min為最佳。

2.1.5 超聲功率單因素試驗結果

超聲功率對黃藥葉總黃酮得率的影響見圖5。

圖5 超聲功率對黃藥葉總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on the yield of total flavonoids in Premna cavaleriei Levl.leaves

由圖5可知，黃藥葉總黃酮得率隨著超聲功率的增加先升高后趨于平穩，當超聲功率150 W時，黃藥葉總黃酮得率最高，為3.82%。隨著超聲功率增強，加大了超聲波的“機械效應”和“空化效應”，可有效減小粉末與溶劑之間的阻滯層，提高樣品的破碎度，增加了總黃酮得率[24-25]；當超聲功率達到一定值時，超聲波產生的“機械效應”和“空化效應”已達最佳，所以在150 W～250 W范圍，黃藥葉總黃酮得率基本保持恒定。因此，適宜超聲功率為150 W。

2.1.6 提取時間單因素試驗結果

提取時間對黃藥葉總黃酮得率的影響見圖6。

圖6 提取時間對黃藥葉總黃酮得率的影響Fig.6 Effect of extraction time on the yield of total flavonoids in Premna cavaleriei Levl.leaves

由圖6可知，提取時間為30 min時，黃藥葉總黃酮得率達到峰值3.58%，當提取時間繼續延長，總黃酮得率呈下降趨勢。可能由于提取時間在0～30 min時，樣品破碎程度迅速增加，黃酮類化合物不斷溶出，提取液中總黃酮得率在30 min時達到最大值，但隨著提取時間延長，部分總黃酮被氧化或分解，導致目標產物得率降低[26]。因此，選擇提取時間為20、30、40 min進行正交試驗。

2.1.7 提取次數單因素試驗結果

提取次數對黃藥葉總黃酮得率的影響見圖7。

圖7 提取次數對黃藥葉總黃酮得率的影響Fig.7 Effect of extraction times on the yield of total flavonoids in Premna cavaleriei Levl.leaves

由圖7可知，隨著提取次數增加，黃藥葉總黃酮得率先快速升高后緩慢升高。提取1次～3次時，總黃酮得率由2.82%快速增至4.19%，提取3次與提取1次相比，總黃酮得率增加48.58%。隨著提取次數進一步增加，提取5次時總黃酮得率為4.74%，與提取3次相比，總黃酮得率增加13.13%。可能因每次更換溶劑進行提取時，不斷形成高滲透壓環境，使得樣品中黃酮類化合物逐次被提取，而樣品中黃酮類化合物含量有限，隨著提取次數進一步增加，黃酮類化合物已基本溶出，總黃酮得率增加緩慢；同時隨著提取次數增加，促進了雜質的溶出，影響了總黃酮的提取[27]。因此，選擇提取次數2、3、4次進行正交試驗。

2.2 正交試驗設計優化超聲波輔助提取法提取工藝

2.2.1 正交試驗設計與結果分析

在單因素試驗結果基礎上，選擇料液比（A）、提取時間（B）、提取次數（C）、乙醇體積分數（D）4個因素，進行四因素三水平正交試驗。其它參數固定為浸泡時間10 min，超聲功率150 W，提取溫度55℃，正交試驗結果與分析見表2。

表2 正交試驗結果與分析Table 2 Experimental results and analyses for optimization of total flavonoids

由表2可知，4個因素極差順序為D＞B＞A＞C，即乙醇體積分數對黃藥葉總黃酮得率影響最大，其次是提取時間、料液比，最后是提取次數。通過比較k值可知，4個因素的最佳水平為A2B3C2D3，即料液比1∶30（g/mL），提取時間 40 min，提取次數 3次，乙醇體積分數70%，由于該條件不在正交試驗的9次試驗中，因此需進一步試驗驗證。

2.2.2 方差分析及最優工藝試驗驗證

方差分析見表3。

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal experiment results for optimization of total flavonoid extraction

由表3可知，上述4個因素對黃藥葉總黃酮得率的影響大小順序是乙醇體積分數＞提取時間＞料液比＞提取次數，與極差分析結果一致。同時，由P值可知4個因素均對黃藥葉總黃酮得率有顯著影響。

為進一步驗證最優工藝可靠性，進行3組平行試驗驗證，得率為分別為6.30%、6.25%和6.00%，均值為6.18%，相對標準偏差為0.13%，驗證試驗總黃酮得率均高于正交表中得率，證實該正交試驗結果可靠，故確定黃藥葉總黃酮的最優提取條件為乙醇體積分數70%，提取次數 3 次，提取時間 40 min，料液比 1∶30（g/mL）。

2.3 黃藥葉總黃酮提取物抗氧化能力測定

黃藥葉總黃酮提取物和L-抗壞血酸抗氧化活性試驗線性擬合結果見表4和表5。

表4 黃藥葉總黃酮提取物抗氧化活性試驗線性擬合結果Table 4 The linearity correlation results of antioxidant activity of total flavonoids from Premna cavaleriei Levl.leaves

表5 L-抗壞血酸抗氧化活性試驗線性擬合結果Table 5 The linearity correlation results of antioxidant activity of L-ascorbic acid

2.3.1 羥自由基清除率測定

黃藥葉總黃酮提取物和L-抗壞血酸對羥自由基的清除作用見圖8。

圖8 黃藥葉總黃酮提取物和L-抗壞血酸對羥自由基的清除作用Fig.8 Hlydroxyl radicals scavenging effects of total flavonoids from Premna cavaleriei Levl.leaves and L-ascorbic acid

由圖 8 可知，在 50 μg/mL～500 μg/mL 范圍內黃藥葉總黃酮提取物清除羥自由基的能力弱于同濃度的L-抗壞血酸，兩者對羥自由基的清除作用均隨濃度的增加而增大，在500 μg/mL時黃藥葉總黃酮提取物對羥自由基的清除率為（51.87±1.18）%，低于L-抗壞血酸的（79.43±2.65）%。另外，由表4和表5可知，L-抗壞血酸的IC50為323.50 μg/mL，而黃藥葉總黃酮提取物的IC50為484.12 μg/mL，是L-抗壞血酸的1.50倍。以上結果表明黃藥葉總黃酮提取物對羥自由基具有較強的清除能力，且與濃度具有量效關系。

2.3.2 DPPH自由基清除率測定

黃藥葉總黃酮提取物和L-抗壞血酸對DPPH自由基的清除作用見圖9。

圖9 黃藥葉總黃酮提取物和L-抗壞血酸對DPPH自由基的清除作用Fig.9 DPPH radical scavenging effects of total flavonoids from Premna cavaleriei Levl.leaves and L-ascorbic acid

由圖9可知，黃藥葉總黃酮提取物清除DPPH自由基的能力弱于同濃度的L-抗壞血酸，兩者對DPPH自由基的清除率隨濃度的增加而增大，到達一定濃度后增長趨于平緩。L-抗壞血酸及黃藥葉總黃酮提取物分別在 0.5 μg/mL ～ 8 μg/mL、0.5 μg/mL ～ 40 μg/mL 范圍時對DPPH自由基的清除率與其濃度相關性較好。由回歸方程得L-抗壞血酸的IC50為4.06 μg/mL，而黃藥葉總黃酮提取物的IC50為18.27 μg/mL，是L-抗壞血酸的4.50倍。在試驗濃度范圍內，當黃藥葉總黃酮提取物濃度為40 μg/mL時，清除率最大為（89.99±0.11）%，僅與L-抗壞血酸相差5.95%。因此，黃藥葉總黃酮提取物對DPPH自由基清除能力雖不及L-抗壞血酸，但也具有一定程度的清除作用。

2.3.3 超氧陰離子自由基清除率測定

黃藥葉總黃酮提取物和L-抗壞血酸對超氧陰離子自由基的清除作用見圖10。

圖10 黃藥葉總黃酮提取物和L-抗壞血酸對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.10 Scavenging ability against superoxide anion radicals of total flavonoids from Premna cavaleriei Levl.leaves and L-ascorbic acid

由圖10可知，當濃度小于10 μg/mL時，黃藥葉總黃酮提取物對超氧陰離子自由基的清除效果較L-抗壞血酸略強；當濃度大于10 μg/mL時，隨著濃度的增大，L-抗壞血酸對超氧陰離子自由基清除能力略優于黃藥葉總黃酮提取物清除能力，當濃度為50 μg/mL時，黃藥葉總黃酮提取物對超氧陰離子自由基清除率為（51.68±0.23）%，而L-抗壞血酸則為（99.30±0.22）%，兩者清除率差值達最大值。黃藥葉總黃酮提取物對超氧陰離子自由基的IC50為46.88 μg/mL，為L-抗壞血酸IC50的2.51倍，表明黃藥葉總黃酮提取物對超氧陰離子自由基的清除能力雖弱于L-抗壞血酸，但仍具有較強的超氧陰離子自由基的清除能力。

2.3.4 鐵離子還原能力

黃藥葉總黃酮提取物和L-抗壞血酸的鐵離子還原能力見圖11。

圖11 黃藥葉總黃酮提取物和L-抗壞血酸的鐵離子還原能力Fig.11 Ferric reducing ability of total flavonoids from Premna cavaleriei Levl.leaves and L-ascorbic acid

鐵離子還原能力以吸光度值衡量，吸光度值越大，還原能力越強。由圖11可知，黃藥葉總黃酮提取物在5 μg/mL～300 μg/mL范圍內，隨著濃度升高吸光度值不斷增大；在300 μg/mL～400 μg/mL時吸光度值趨于平穩且與L-抗壞血酸吸光度曲線重合，表明黃藥葉總黃酮提取物具有較強的鐵離子還原能力。

3 結論

本文采用超聲波輔助提取法提取武當山地區野生黃藥葉總黃酮，通過單因素試驗和正交試驗優化提取工藝，獲取最佳工藝條件為乙醇體積分數70%，提取次數 3 次，提取時間 40 min，料液比 1∶30（g/mL），此工藝條件下，得率為6.18%，即提取量為61.8 mg/g。與傳統醇提法相比，本研究所得最佳提取工藝條件可縮短提取時間，避免長時間提取對活性成分的影響，提高黃藥葉總黃酮的提取量和效率。此外體外抗氧化活性研究表明，黃藥葉總黃酮提取物對羥自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基均具有清除作用，且具較強的鐵離子還原能力；同時在一定濃度范圍內，抗氧化能力與濃度呈正相關。黃藥葉總黃酮提取物對羥自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基的IC50為484.12、18.27、46.88 μg/mL，分別為 L-抗壞血酸的1.50、4.50、2.51倍；此外，其鐵離子還原能力略低于L-抗壞血酸。本文首次對武當山野生黃藥葉總黃酮提取工藝及體外抗氧化活性進行研究，可為當地野生黃藥葉明確營養成分及活性物質奠定研究基礎，以及為黃藥藥食同源相關產品開發提供了理論支撐。