響應面優化提取美藤果油及其對高強度運動大鼠腓腸肌功能恢復和ATP酶的影響

齊婷，房磊

（1.吉林化工學院，吉林 吉林 132022；2.吉林農業科技學院，吉林 吉林 132101）

美藤果（Plukenetia volubilis Linneo），別名印加果、印奇果，是一種大戟科木質藤本植物，原生長在南美洲，其種植周期短、營養價值高，是一種高油脂、高蛋白的新型木本油料作物[1-2]。2006年，美藤果由中國科學院西雙版納熱帶植物園引種成功，2013年美藤果油獲批為新資源食品。美藤果的主要成分有油脂、蛋白質、糖類、多酚類、維生素E以及Ca、P、K等礦物質元素[3-4]。

美藤果油的脂肪酸組成豐富，主要以不飽和脂肪酸為主，包括亞麻酸、亞油酸、油酸、棕櫚酸、硬脂酸等，且均為人體所需要的不飽和脂肪酸，其中亞麻酸含量高于40%，明顯高于除亞麻籽油之外的植物油[5]。美藤果油中的活性成分還包括多酚、生育酚、甾醇、胡蘿卜素等，其中生育酚含量約為1.6 g/kg[6]、多酚含量約為62 mg/kg[7]。研究表明，美藤果油具有降低血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、降低收縮血壓和舒張血壓、提高高密度脂蛋白水平的作用。其含有的多不飽和脂肪酸、維生素、多酚類物質具有較強的抗氧化作用，并且抗氧化效果優于橄欖油、茶油、亞麻籽油和紫蘇油[8]。同時美藤果油中的亞油酸和亞麻酸還具有調節免疫機能的作用[9]。本文采用響應面優化萃取美藤果油，利用大鼠高強度運動，研究其對大鼠腓腸肌功能恢復和ATP酶的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

美藤果：昆明彩云之南生物科技有限公司；正己烷（分析純）：天津科密歐化學試劑有限公司；過氧化物酶（peroxidase，POD）試劑盒、乳酸（lactic acid，LA）試劑盒、琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）試劑盒：南京建成生物科技公司；三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）試劑盒：上海索寶生物科技有限公司。

SPF級雄性SD大鼠50只，體重（120±5）g，廣州市白云區龍歸興科動物養殖場，許可證號SCXK（粵）2017-0042。

1.2 儀器與設備

ZW-CLJ-5型超臨界萃取儀：澤望自動化設備（上海）有限公司；RV-211M型旋轉蒸發儀：上海一恒科學儀器有限公司；YJ-GS-300型電子天平：上海亞津電子科技有限公司；CK-CWYCJ型粉碎機：永康市圣象電器有限公司；TG-16W型高速離心機：濟南歐萊博科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 美藤果油的制備

首先將美藤果去皮，挑選飽滿的美藤果仁，并將其粉碎過60目篩，放在40℃真空干燥箱干燥4 h，稱取適量的美藤果仁粉，將美藤果仁粉裝入萃取釜中，在不同萃取壓力、萃取溫度、萃取時間等條件下進行超臨界萃取。萃取結束，收集美藤果油[10-11]。

Y/%=m/M×100

式中：Y為美藤果油得率，%；m為美藤果油質量，g；M為美藤果仁粉末質量，g。

1.3.2 單因素試驗

在萃取溫度55℃、萃取時間100 min條件下，設定不同萃取壓力為 10、15、20、25、30 MPa，考察萃取壓力對美藤果油得率的影響；在萃取壓力為20 MPa、萃取時間100 min條件下，設定不同萃取溫度為40、45、50、55、60℃，考察萃取溫度對美藤果油得率的影響；在萃取壓力20 MPa、萃取溫度55℃條件下，設定不同萃取時間為 60、80、100、120、140 min，考察萃取時間對美藤果油得率的影響。

1.3.3 響應面法優化美藤果油提取工藝

在單因素試驗的基礎上，以美藤果油得率（Y）為指標，選取對美藤果油得率影響較大的3個因素進行試驗，以萃取壓力（X1）、萃取溫度（X2）和萃取時間（X3）為考察因素，進行三因素三水平響應面試驗設計，試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素水平Table 1 Box-Behnken design factor level

1.3.4 分組及運動方案

選取SPF級雄性SD大鼠50只，體重（120±5）g，自由飲食，飼養環境（23±2）℃。分成5組，每個小組10只大鼠，分成對照組、運動組和低、中、高劑量美藤果油組。低、中、高劑量美藤果油組每天灌胃10、15、20 mg/g美藤果油，運動組灌胃15 mg/g生理鹽水。其中對照組不進行任何運動，其它4組進行游泳訓練，實驗時間6周。將大鼠放入游泳池內，大鼠的尾部負重其體重8%的鉛絲，從大鼠進入到游泳池開始，到大鼠力竭的這段周期，沉入水中8 s不能浮到水面停止實驗。大鼠在6周實驗結束之后，所有大鼠進行腹腔麻醉（10%的水合氯醛），處死后取腓腸肌，放入液氮以備指標測定，并對相關指標POD、SDH、ATP酶、乳酸等指標根據酶學試劑盒的說明書檢測分析[12]。

1.4 統計學分析

使用SPSS 20.0軟件進行數據分析，數據均使用平均值±標準差來表示，采取組間進行對比，P＜0.05表示具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 萃取壓力對美藤果油得率的影響

萃取壓力對美藤果油得率的影響見圖1。

圖1 萃取壓力對美藤果油得率的影響Fig.1 Effect of extraction pressure on the yield of Rattan oil

由圖1可知，隨著萃取壓力的逐漸增加，美藤果油得率逐漸提高，當萃取壓力達到20 MPa時，美藤果油得率達到最高，繼續增加萃取壓力，美藤果油得率呈下降趨勢。這是因為過高的萃取壓力可以使流體的擴散性和對流性有所下降，傳質速率降低，使得美藤果油得率降低，并且增加萃取壓力會使實際操作增加危險性。綜上，選擇萃取壓力為20 MPa。

2.1.2 萃取溫度對美藤果油得率的影響

萃取溫度對美藤果油得率的影響見圖2。

圖2 萃取溫度對美藤果油得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of Rattan oil

由圖2可知，隨著萃取溫度的逐漸增加，美藤果油得率逐漸提高，當萃取溫度達到55℃時，美藤果油得率達到最高；繼續增加萃取溫度，美藤果油得率呈下降趨勢。這是因為溫度升高可以增加油脂分子的擴散運動，使得美藤果油更容易萃取出來，得率提高。但是萃取溫度過高，會發生氧化反應破壞美藤果油的結構。綜上，選擇萃取溫度為55℃。

2.1.3 萃取時間對美藤果油得率的影響

萃取時間對美藤果油得率的影響見圖3。

圖3 萃取時間對美藤果油得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of Rattan oil

由圖3可知，隨著萃取時間的延長，美藤果油得率逐漸提高，當萃取時間達到100 min時，美藤果油得率達到最高，繼續延長萃取時間，美藤果油得率幾乎不變，說明此時美藤果油已經幾乎完全被萃取。綜上，選擇萃取時間為100 min。

2.2 響應面法試驗結果與分析

在單因素試驗的基礎上，確定各因素最佳水平值范圍，以美藤果油得率（Y）為指標，設計Box-Behnken試驗中心組合試驗。響應面分析方案與結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

采用Design-Expert 8.0軟件對表2試驗數據進行多元回歸擬合，得到多元回歸方程：Y=50.04+0.36X1+0.32X2+1.19X3-0.15X1X2+0.17X1X3+0.13X2X3-1.90X12-2.53X22-1.34X32。

該模型回歸分析見表3。模型P=0.000 1<0.01極顯著，失擬項P=0.300 6>0.05不顯著，證明失擬處理不顯著，實驗誤差較小。相關系數R2=0.998 7，調整系數也表明上述模型擬合程度較好，該模型可用于萃取美藤果油。對美藤果油得率影響順序依次為萃取時間>萃取壓力>萃取溫度。并且萃取時間、萃取壓力和萃取溫度影響都達到了極顯著水平（P<0.01）；X1X2達到顯著水平（P<0.05）、X1X3達到顯著水平（P<0.05）；上述各因素的二次項均對得率影響極顯著（P<0.01）。萃取壓力與萃取溫度的響應面分析、萃取壓力與萃取時間的響應面分析見圖4和圖5。

表3 響應面回歸模型ANOVA分析結果Table 3 ANOVA analysis results of response surface regression model

圖4 萃取壓力與萃取溫度的響應面分析Fig.4 Response surface analysis of extraction pressure and temperature

圖5 萃取壓力與萃取時間的響應面分析Fig.5 Response surface analysis of extraction pressure and extraction time

從圖4分析得出，萃取壓力與萃取溫度對得率的影響較為明顯。由于3D曲面較為陡峭，同時兩者之間交互作用較為明顯，等高線為橢圓形；從圖5分析得出，萃取壓力與萃取時間對得率的影響較為明顯。由于3D曲面較為陡峭，同時兩者之間交互作用較為明顯，等高線為橢圓形。

通過上述分析得美藤果油最佳萃取條件為萃取壓力20.56MPa、萃取溫度55.36℃、萃取時間109.08min時，此時美藤果油得率為50.34%。考慮到實際操作情況，修正成萃取壓力為21 MPa、萃取溫度為55℃、萃取時間為109 min，選取該組合做3次平行試驗，得出美藤果油的平均得率為50.15%。與預測值相近，證明該工藝可以用來萃取美藤果油。

2.3 美藤果油對高強度大鼠腓腸肌功能恢復和ATP酶的影響

美藤果油對高強度大鼠腓腸肌功能恢復和ATP酶的影響見表4。

表4 美藤果油對高強度大鼠腓腸肌功能恢復和ATP酶的影響Table 4 Effect of Rattan oil on functional recovery and ATPase of gastrocnemius muscle in high-intensity rats

從表4可知，運動組與對照組相比POD活性顯著降低（P<0.05），低、中、高劑量美藤果油組POD活性呈上升趨勢，高劑量組的POD活性與運動組相比顯著提高（P<0.05）；運動組與對照組相比SDH水平顯著降低（P<0.05），低、中、高劑量美藤果油組SDH水平呈上升趨勢，高劑量組的SDH水平與運動組相比顯著提高（P<0.05）；運動組與對照組相比乳酸含量顯著提高（P<0.05），低、中、高劑量美藤果油組乳酸含量呈下降趨勢，高劑量組的乳酸含量與運動組相比顯著降低（P<0.05）；運動組與對照組相比ATP酶水平顯著降低（P<0.05），低、中、高劑量美藤果油組ATP酶水平呈上升趨勢，高劑量組的ATP酶水平與運動組相比顯著提高（P<0.05）。POD是機體內抗氧化酶之一，擔負著體內氧自由基的清除作用，使超氧離子維持在正常水平，實驗結果顯示高強度運動后，運動組大鼠腓腸肌POD活性明顯降低，說明高強度運動后機體相對缺氧，腓腸肌內的細胞質中的鈣離子濃度增加，機體耗氧量水平增加，產生大量自由基，機體抗氧化能力降低，進而影響健康[13]。而SDH是糖在有氧氧化過程中的關鍵酶，是腓腸肌內線粒體的一種標志酶[14]。乳酸是高強度運動中產生的產物，在缺氧條件下，糖酵解能量代謝產生大量乳酸，乳酸會導致腓腸肌的收縮能力下降，使糖酵解供能速率下降，減少了ATP酶合成，最終導致運動能力下降[15]。大鼠灌胃美藤果油后，由于其具有較強的抗氧化能力，可以提高POD活性和SDH水平，減少乳酸的產生，提高ATP酶合成能力，清除機體內產生的自由基，避免了脂質過氧化，緩解運動性疲勞，進而使得大鼠腓腸肌功能恢復。

3 結論

通過超臨界CO2得美藤果油最佳萃取條件為萃取壓力20.56MPa、萃取溫度55.36℃、萃取時間109.08 min時，美藤果油得率50.34%。考慮到實際操作情況，修正成萃取壓力為21 MPa、萃取溫度為55℃、萃取時間為109 min，選取該組合做3次平行試驗，得出美藤果油的平均得率為50.15%。與預測值相近，證明該工藝可以用來萃取美藤果油。大鼠實驗表明，灌胃美藤果油后，由于其具有較強的抗氧化能力，可以提高POD活性和SDH水平，減少乳酸的產生，提高ATP酶合成能力，清除機體內產生的自由基，避免脂質過氧化，緩解運動性疲勞，進而使得大鼠腓腸肌功能恢復，為以后美藤果油的研究提供了寶貴經驗。