李志強(qiáng)，王書利，李欣欣，張倪晨，席麗，崔艷艷

(商丘師范學(xué)院 生物與食品學(xué)院，河南 商丘 476000)

布魯氏菌(Brucella)為革蘭氏陰性菌，是人和動物機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的兼性病原體，能夠在專業(yè)和非專業(yè)的吞噬細(xì)胞內(nèi)繁殖[1]，引起人和多種動物發(fā)生疾病，給人類帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[2].布魯氏菌可在動物體內(nèi)引起急性傳染病和妊娠動物的流產(chǎn)[3].人布魯氏菌病的癥狀是發(fā)燒、關(guān)節(jié)炎、感染性心內(nèi)膜炎、脾膿腫、敗血癥和脊椎炎[4,5].在宿主體內(nèi)，為了促進(jìn)細(xì)菌繁殖，布魯氏菌必須適應(yīng)惡劣的胞內(nèi)環(huán)境脅迫，或影響某些信號途徑和蛋白的表達(dá).已經(jīng)證實布魯氏菌中存在多種應(yīng)激相關(guān)蛋白和毒力相關(guān)蛋白，但其潛在致病機(jī)制尚不清楚.

已有研究表明pgk基因編碼磷酸甘油酸激酶.PGK將磷酸基從1,3-二磷酸甘油酯轉(zhuǎn)移到ADP，形成ATP和3-磷酸甘油酯，是糖酵解和糖異生生成ATP的重要步驟[6].因此，PGK是布魯氏菌非常重要的激酶.已有研究表明，布魯氏菌pgk突變體在骨髓源巨噬細(xì)胞和小鼠體內(nèi)的毒力是減弱的[7].所以，PGK與布魯氏菌的毒力有關(guān).本研究評價了2308Δpgk突變株在環(huán)境壓力下的生存能力，以及對巨噬細(xì)胞的毒性作用，目的是進(jìn)一步揭示布魯氏菌中PGK的作用.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、培養(yǎng)基和細(xì)胞系

布魯氏菌S2308親本株和2308Δpgk突變株為本研究室保存；布魯氏菌液體培養(yǎng)基(TSB)和布魯氏菌固體培養(yǎng)基(TSA)購自美國BD公司；瓊脂粉購自日本Biosharp公司；氯化鈉購自上海生工生物工程股份有限公司；CytoTox 96非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自美國Promega公司；小鼠巨噬細(xì)胞系(RAW 264.7)購自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心.

1.1.2 主要試劑

多粘菌素B和脫氧膽酸鈉購自德國Sigma公司；慶大霉素購自美國Invitrogen公司；DMEM高糖、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司.

1.2 方法

1.2.1 體外環(huán)境壓力實驗

將S2308、2308Δpgk和2308Δpgk-C接種于10 mL TSB培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長早期(OD600=0.6).然后將細(xì)菌培養(yǎng)至指數(shù)生長期，接種于1.5 M NaCl和3.0 M NaCl中，刺激30 min.另外，在37 ℃培養(yǎng)條件下，將細(xì)菌在pH為2、4、6、8、10、12的TSB培養(yǎng)基中刺激5 min.或者將指數(shù)生長期的細(xì)菌轉(zhuǎn)移至預(yù)熱40 ℃、50 ℃或60 ℃的TSB培養(yǎng)基中，在40 ℃、50 ℃或60 ℃下孵育1 h.刺激后將各組細(xì)菌離心后，10倍梯度稀釋，選擇合適的稀釋度涂布TSA平板，對細(xì)菌進(jìn)行CFU計數(shù)，以在正常TSB培養(yǎng)基中生存的細(xì)菌為對照(存活率100%)，計算各組細(xì)菌的存活率.實驗重復(fù)3次，每次3個平行.

1.2.2 多粘菌素B敏感性實驗

按照文獻(xiàn)報道的方法測定S2308、2308Δpgk和2308Δpgk-C對多粘菌素B[8]和脫氧膽酸鈉的敏感性.離心培養(yǎng)至對數(shù)生長中期(OD600=1.0)的S2308、2308Δpgk和2308Δpgk-C，用PBS緩沖液，制備成約1 × 104CFU/mL的細(xì)菌懸液.將100 μL細(xì)菌懸液與100 μL不同濃度的多粘菌素B(終濃度分別為0.5 mg/mL、1 mg/mL和2 mg/mL)或脫氧膽酸鈉(終濃度分別為0.1 mg/mL、0.2 mg/mL和0.4 mg/mL)混合后培養(yǎng)于96孔板中.在37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)1 h，取50 μL進(jìn)行10倍梯度稀釋后，選擇合適的稀釋度涂布TSA平板，對細(xì)菌進(jìn)行CFU計數(shù).以未加多粘菌素B和脫氧膽酸鈉的細(xì)菌為對照(存活率100%)，用存活菌的CFU除以接種菌的CFU，計算存活率.實驗重復(fù)3次，每次3個平行.

1.2.3 巨噬細(xì)胞毒性實驗

按照文獻(xiàn)報道的方法，分別用50∶1、100∶1和1000∶1感染復(fù)數(shù)(MOI)的S2308、2308Δpgk和2308Δpgk-C感染小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7，用CytoTox 96非放射性細(xì)胞性法測定LDH水平[11].將小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7培養(yǎng)至6孔板內(nèi)，細(xì)胞在37 ℃、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)至單層(約1 × 105個/孔)，分別用50∶1、100∶1和1000∶1感染復(fù)數(shù)(MOI)的S2308、2308Δpgk和2308Δpgk-C感染細(xì)胞.感染后的細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，感染45 min后，細(xì)胞用不含抗生素的DMEM培養(yǎng)液漂洗兩次，隨后加入含50 μg/mL慶大霉素的DMEM，孵育1 h，殺死胞外菌.1 h后棄去培養(yǎng)液，加入新鮮的含25 μg/mL慶大霉素的DMEM培養(yǎng)液(此時定義為0 h).在感染后12 h、24 h和48 h，按照試劑盒說明書測定LDH水平.實驗重復(fù)3次，每次3個平行.

1.2.4 統(tǒng)計分析

細(xì)菌對多粘菌素B、脫氧膽酸鈉的敏感性和巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性以平均值±SD表示.用SPSS 17.0分析突變株與親本株之間的差異性，當(dāng)P值< 0.05時，差異顯著；P值< 0.01時，差異極顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 PGK對應(yīng)激條件下布魯氏菌存活的影響

布魯氏菌可以在宿主細(xì)胞中生存，必須適應(yīng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境.為了確定pgk突變是否影響布魯氏菌對細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的適應(yīng)，比較了S2308、2308Δpgk和2308Δpgk-C菌株在模擬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的各種應(yīng)激條件下的存活率.這些脅迫環(huán)境包括高鹽環(huán)境(1.5 M和3.0 M NaCl)、酸堿環(huán)境(pH 2、4、6、8、10或12)和熱休克環(huán)境(40 ℃、50 ℃或60 ℃).在不同的應(yīng)激條件下，2308Δpgk的存活率明顯低于S2308和2308Δpgk-C(P< 0.05)(圖1).在3.0M NaCl刺激條件下，各菌株的存活率明顯低于1.5M NaCl刺激條件下的存活率(圖1A).在pH 2、4、8、10、12刺激條件下，各菌株的存活率均低于pH 6刺激條件下的存活率(圖1B).在不同溫度下熱休克處理后，各菌株的存活率隨溫度的升高而降低(圖1C).結(jié)果表明，pgk的缺失改變了布魯氏菌對環(huán)境的適應(yīng)性，PGK對布魯氏菌適應(yīng)應(yīng)激環(huán)境具有重要意義.

圖1 布魯氏菌對體外應(yīng)激的敏感性Figure 1 Sensitivity of Brucella to in vitro stressesNote:Brucella strains were grown in TSB to the early logarithm phase,then treated with (A) high salt,(B) different pH and (C) heat shock.After the treatment,the survival percentage of the bacteria was determined.Significant differences between 2308Δpgk mutant and S2308 parental strain are indicated by * (P < 0.05),** (P < 0.01).

2.2 PGK對多粘菌素B和脫氧膽酸鈉的敏感性

為了評定2308Δpgk突變體對多粘菌素B和脫氧膽酸鈉的敏感性，我們測定了2308Δpgk突變體在多粘菌素B和脫氧膽酸鈉處理下的存活情況.結(jié)果表明，與S2308和2308Δpgk-C相比，多粘菌素B和脫氧膽酸鈉處理后，2308Δpgk的存活率顯著降低(P< 0.05)(圖2).此外，2308Δpgk突變體隨著多粘菌素B和脫氧膽酸鈉濃度的降低而敏感性增加(圖2).結(jié)果表明，PGK的失活導(dǎo)致布魯氏菌對多粘菌素B和脫氧膽酸鈉的敏感性增加.

圖2 布魯氏菌對多粘菌素B和脫氧膽酸鈉的敏感性Figure 2 Sensitivity of Brucella to polymyxin B and sodium deoxycholateNote:S2308,2308Δpgk and 2308Δpgk-C of approximately 1×104 CFU/mL were prepared and treated with (A) polymyxin B or (B) sodium deoxycholate.After 1 h of treatment,the survival percentage was determined.Significant differences between 2308Δpgk mutant and S2308 parental strain are indicated by * (P< 0.05),** (P< 0.01).

2.3 PGK調(diào)節(jié)S2308對巨噬細(xì)胞的殺傷作用

為了檢測S2308對巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性是否受PGK調(diào)節(jié)，我們用S2308、2308Δpgk和2308Δpgk-C以50,100和1000的MOI感染的原代264.7細(xì)胞，測定LDH釋放水平.當(dāng)MOI為50∶1時，在感染后的不同時間，對乳酸脫氫酶的釋放水平，菌株之間沒有顯著差異(圖3A).當(dāng)MOI為100∶1時，在感染后12 h，S2308感染細(xì)胞和2308Δpgk-C感染細(xì)胞LDH釋放率分別為(33.12 ± 1.11)%和(31.93 ± 1.62 )%；而2308Δpgk感染的巨噬細(xì)胞的LDH釋放率僅為(3.75 ± 0.26 )%(圖3B).在感染后24 h，S2308感染細(xì)胞和2308Δpgk-C感染細(xì)胞LDH釋放率分別為(46.38 ± 2.15 )%和(44.55 ± 0.57 )%；而2308Δpgk感染的巨噬細(xì)胞的LDH釋放率僅為(7.94 ± 0.09 )%(圖3B).當(dāng)MOI為1000:1時，在感染后12 h，S2308感染細(xì)胞和2308Δpgk-C感染細(xì)胞LDH釋放率分別為(59.03 ± 2.08 )%和(57.52 ± 1.59 )%；而2308Δpgk感染的巨噬細(xì)胞的LDH釋放率僅為(2.95 ± 0.72 )%(圖3C).在感染后24 h，S2308感染細(xì)胞和2308Δpgk-C感染細(xì)胞LDH釋放率分別為(73.55 ± 1.57 )%和(71.84 ± 2.38 )%；而2308Δpgk感染的巨噬細(xì)胞的LDH釋放率僅為(6.83 ± 0.79 )%(圖3C).然而，在感染后48 h，感染S2308、2308Δpgk和2308Δpgk-C的巨噬細(xì)胞中，所有MOI的細(xì)胞都顯示出高水平的LDH釋放率(圖3).結(jié)果表明，2308Δpgk突變株在感染后12 h和24 h內(nèi)在任何MOI中均不誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生高水平的細(xì)胞毒性.此外，在感染后48 h，所有菌株對巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性均增高，可能是由于長期感染時間而導(dǎo)致營養(yǎng)缺乏的結(jié)果.因此，感染后48 h，各菌株對巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性無明顯差異.結(jié)果表明，S2308對細(xì)胞的毒性受PGK調(diào)節(jié).

圖3 PGK調(diào)節(jié)布魯氏菌對巨噬細(xì)胞的殺傷作用Figure 3 PGK-regulated cytotoxicity of Brucella against macrophagesNote:RAW 264.7 macrophages were infected with S2308,2308Δpgk and 2308Δpgk-C at MOIs of (A) 50,(B) 100 and (C) 1000.Macrophage cytotoxicity was determined at different times post-infection using the LDH release assay.Significant differences among 50 MOI,100 MOI and 1000 MOI are indicated by ** (P< 0.01).

3 討 論

布魯氏菌需要適應(yīng)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境，逃避宿主固有和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，才能成功存活[12].已有研究表明，布魯氏菌pgk突變株在細(xì)胞和小鼠體內(nèi)的存活能力降低，在控制細(xì)菌毒力方面發(fā)揮了重要作用[7].為了更好地在宿主細(xì)胞中生存，布魯氏菌逐步具備了適應(yīng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的能力，如熱休克、酸性pH值和高鹽[13].在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)2308Δpgk在高鹽、不同pH和熱休克的脅迫條件下降低了其存活能力.此外，研究還發(fā)現(xiàn)在2308δPGK中，多粘菌素B和脫氧膽酸鈉的敏感性增加.這些結(jié)果表明PGK可能在布魯氏菌存活中發(fā)揮重要作用.

已有研究報道表明，布魯氏菌可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性[14].近年來，Lei和Li等人研究發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌的細(xì)胞毒性依賴于熱休克蛋白HFQ、二元調(diào)控系統(tǒng)TceSR和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子GntR.在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌的細(xì)胞毒性也受到PGK的調(diào)節(jié).這意味著布魯氏菌對巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性不僅僅取決于IV分泌系統(tǒng)(T4SS)、二元調(diào)控系統(tǒng)(TCS)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子.

在本研究中，我們的研究表明，2308Δpgk增加了對體外應(yīng)激條件、多粘菌素B和脫氧膽酸鈉的敏感性.此外，我們還觀察到PGK調(diào)節(jié)布魯氏菌對巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性.這些結(jié)果表明PGK參與了布魯氏菌的胞內(nèi)外存活.然而，PGK的功能仍需進(jìn)一步研究.