益景湯對早期糖尿病大鼠腦微血管病變的影響及作用機制

王 麗，劉光輝，林 韻，張洪生，高愛明，孟 春，趙 利，周子鑫

（1.福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350004；2.福州大學生物科學與工程學院，福建 福州 350108）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）已成為危害人類健康最大的疾病之一，中國是目前全球糖尿病患者人數(shù)最多的國家，2017 年流行病學調(diào)查顯示中國糖尿病總患病率高達11.2%［1］。 DM 并發(fā)癥眾多，長期高血糖會導致患者出現(xiàn)不同程度的學習和記憶能力下降，嚴重者會出現(xiàn)認知功能障礙甚至癡呆，臨床稱此為糖尿病腦病（diabeticencephalopathy，DE），發(fā)病原因可能與長期高血糖導致腦微血管病變有關［2］，具體機制尚不十分明確。

有研究表明：DM 代謝產(chǎn)物——晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end-products，AGEs）能夠激活TGF-β1／Smads 信號通路，誘導腦微血管相關結構蛋白表達異常，損傷血腦屏障，引起腦微血管病變［3］。 益景湯是福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院治療DM 微血管病變的有效經(jīng)驗方， 臨床應用多年。本團隊臨床研究表明益景湯能夠改善DM 患者眼部微血管循環(huán)［4-6］，降低糖尿病心肌病的血清學指標，對糖尿病心肌病有較好療效［7］，可有效改善早期DM 腎病患者癥狀［8］。 動物實驗表明益景湯能夠改善DM 大 鼠 眼 部［9-11］、心 臟［12］、腎 臟［13］的 血 流 動 力學，保護相應的器官功能，但在治療腦微血管病變方面尚無相應研究。 本研究擬在前期研究基礎上，采用DM 大鼠模型，基于TGF-β1／Smads 信號通路，研究益景湯對早期DM 腦微血管病變的影響。

1 材 料

1.1 實驗動物 雄性健康清潔級SD 大鼠，鼠齡5～6 周，體質量（200±20）g，購買自福州諾頓斯生物科技有限公司，合格證號：20170012009954，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心，許可證號：SYXK（閩）2020-0002，飼養(yǎng)環(huán)境溫度21～25 ℃，相對濕度為50%～55%。 普通顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水，12 h／12 h 明暗交替光照。 實驗動物的處理按國家科學技術委員會1988 年頒布的《實驗動物管理條例》執(zhí)行。

1.2 實驗試劑 鏈脲佐菌素（美國Sigma-Aldrich 公司）；一抗（英國Abcam 公司），包括：晚期糖基化終產(chǎn)物特異性受體（RAGE）、轉化生長因子β1（TGFβ1）、同源物4 重組蛋白（Smad4）、纖維連接蛋白（fibronectin）、緊密連接蛋白5（claudin-5）、Ⅳ型膠原蛋白（collagenⅣ）；二抗（福州邁新生物技術開發(fā)有限公司）；WB 試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；檸檬酸鹽（北京中杉金橋生物技術有限公司）；10%中性福爾馬林固定液（北京百奧萊博科技有限公司）；血糖試紙（拜耳醫(yī)藥保健有限公司）。

1.3 實驗藥物 益景湯（福建省名老中醫(yī)金威爾有效經(jīng)驗方），組成：生黃芪15 g，山藥15 g，蒼術9 g，桃仁5 g，紅花5 g，當歸9 g，川芎6 g，赤芍10 g，茯苓15 g，生地黃15 g，玄參15 g。 每劑水煎至50 mL（藥物濃度約2.38 g／mL），滅菌玻璃瓶灌裝，密封避光備用。

2 方 法

2.1 造模及分組 將健康雄性清潔級SD 大鼠30 只隨機分為正常組、模型組、益景湯組，每組10 只。 正常組常規(guī)喂養(yǎng)，其余2 組進行DM 模型制備［11］。適應性喂養(yǎng)7 d，禁食12 h 后，將鏈脲佐菌素用0.1 mmol／L、pH 值4.5 的無菌檸檬酸緩沖液溶解，配置成1%溶液后，按70 mg／kg 劑量進行一次性腹腔注射。 72 h 后取大鼠尾血檢測血糖，血糖濃度≥16.7 mol／L 即視為DM 模型制備成功。

2.2 給藥 正常組常規(guī)喂養(yǎng)；益景湯組予益景湯水煎液灌胃，按10.71 g／（kg·d）計算，取藥1.35 mL，加蒸餾水稀釋至3 mL，一次性灌胃，每日1 次；模型組給予生理鹽水3 mL／d 一次性灌胃，每日1 次。 2 組分別干預16 周。

2.3 取材及制片 各組大鼠干預16 周后，采用一氧化二氮吸入麻醉后，記錄體質量；脫椎處死3 組大鼠，剪開顱骨，剝離出完整腦組織，記錄腦實質重量，并測量體積。 沿矢狀面對剖，取一半放入液氮保存，另一半沿矢狀面2 mm 厚度切片，放入包埋盒，投入10%中性福爾馬林固定24 h 后行病理切片制備。

2.4 Western blot 檢測 取出3 組液氮保存的腦組織，勻漿、裂解后置入離心管中，4 ℃條件下離心5 min，取上清液進行蛋白含量測定；SDS-PAGE 凝膠電泳；將3 組蛋白轉移至硝酸纖維素薄膜，5%牛奶37 ℃封閉1 h 后，加入RAGE、TGF-β1、Smad4、fibronectin、claudin-5、collagen Ⅳ和GAPDH 一 抗，4℃孵 育 過夜；TBST 洗膜3 次，每次5 min，加入二抗37 ℃孵育2 h；TBST 洗膜3 次，ECL 發(fā)光、顯影、定影后室溫下晾干、掃描，以GAPDH 作為內(nèi)參，凝膠圖像處理系統(tǒng)分析各目標帶的分子量和凈光密度值，獲取目的蛋白的相對表達量。

2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0 進行統(tǒng)計學分析。 計量資料屬正態(tài)分布的以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用最小顯著性差異法（LSD 法）。

3 結 果

3.1 3 組大鼠一般情況比較 見表1。

表1 各組大鼠一般情況比較（±s）

表1 各組大鼠一般情況比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

腦實質重量／g 1.91±0.15 1.59±0.031）1.73±0.061）組別正 常 組模 型 組益景湯組n 10 10 10體質量／g 519.02±21.39 196.28±22.491）211.30±27.301）腦體積／cm3 3.81±0.66 2.09±0.291）3.49±0.592）

3.2 3 組大鼠腦微血管的光鏡觀察 重點觀察3 組大鼠腦組織海馬區(qū)域。 正常組腦組織見少量毛細血管增生，管壁薄，無充血、出血；益景湯組與正常組比較，毛細血管略增生，管壁稍增厚，管腔稍充血；與模型組比較，毛細血管增生緩解，血管壁相對較薄，未見明顯充血及出血區(qū)域。 見圖1。

圖1 光鏡下3 組大鼠腦微血管形態(tài)觀察（×400）

3.3 3 組大鼠腦神經(jīng)細胞的光鏡觀察 重點觀察3 組大鼠腦組織海馬區(qū)域。 正常組腦組織海馬結構清晰，神經(jīng)元、膠質細胞數(shù)量及形態(tài)正常；益景湯組與正常組比較，膠質細胞數(shù)量明顯增加；與模型組比較，缺血神經(jīng)元明顯減少，未見神經(jīng)纖維纏結，膠質細胞數(shù)量增多、體積增大。 見圖2。

圖2 光鏡下3 組大鼠腦神經(jīng)細胞形態(tài)觀察（×400）

3.4 3 組對大鼠TGF-β1／Smads 信號通路相對蛋白表達量比較 見圖3。

圖3 3 組TGF-β1／Smads 信號通路相對蛋白表達量比較

4討 論

DE 是DM 微血管并發(fā)癥之一， 其發(fā)病原因可能與腦微血管病變導致腦部缺血有關［14-15］。 與機體其他血管系統(tǒng)比較，腦微血管分布錯綜復雜，機體為了保障腦內(nèi)微環(huán)境的穩(wěn)定，形成了一個特殊的微血管結構——血腦屏障（BBB），主要由血管內(nèi)皮細胞、周細胞和星形膠質細胞組成［16-17］。 血管內(nèi)皮細胞通過緊密連接蛋白彼此緊密連接，奠定了BBB最基本的結構基礎，血管基底膜進一步維持其結構的穩(wěn)定性。claudin-5 是構成細胞間緊密連接的主要組分，在內(nèi)皮細胞上高表達，有研究表明claudin-5 缺失會導致BBB 發(fā)生選擇性滲漏［18］。 BBB 的基底膜主要由細胞外基質組成， 包括fibronectin、collagenⅣ等［19］。

有研究表明：機體在長期高血糖狀態(tài)下，AGEs 過度積累，與腦血管內(nèi)皮細胞與周細胞表面的RAGE結合，激活下游信號通路，導致腦微血管病變［20］。TGF-β1／Smads 信 號 通 路 是 其 中 的 重 要 通 路［21］，AGEs 與RAGE 結合后，誘導腦血管內(nèi)皮細胞、周細胞表達TGF-β1，激活Smads 信號通路，Smad2／3 磷酸化后與關鍵亞基Smad4 形成異聚復合體，將信號從胞漿轉移到胞核中。 一方面誘導腦血管內(nèi)皮細胞、周細胞分泌fibronectin、collagenⅣ，導致血管基底膜增厚，管腔變窄，加上糖尿病患者脂質代謝紊亂，血液黏稠度升高，血流緩慢，導致微血栓形成或微血管閉塞，使腦血流灌注明顯減少；另一方面抑制內(nèi)皮細胞分泌claudin-5，破壞細胞間的緊密連接，破壞BBB 的完整性，使BBB 通透性升高，破壞大腦微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，引起神經(jīng)元的損害和凋亡，最終導致DE 的發(fā)生［22］。

中醫(yī)學認為DE 屬于“健忘”“呆癥”范疇，基本病機以氣陰兩虛為本，以血瘀為標。 長期糖尿病導致氣虛血行無力，瘀血內(nèi)停，阻滯腦絡，蒙蔽腦竅。因此DE 的中醫(yī)治療應以“益氣養(yǎng)陰、活血通絡”為原則。

益景湯是我院用于防治早期DM 微血管病變的有效經(jīng)驗方，臨床應用20 余年，是福建省名老中醫(yī)金威爾在益氣活血名方——補陽還五湯的基礎上，去地龍，加山藥、蒼術、茯苓、玄參、生地黃而成。方中生黃芪益氣，生地黃、玄參養(yǎng)陰生津，山藥、蒼術、茯苓健脾，桃仁、紅花、當歸、川芎、赤芍活血化瘀。 全方共奏益氣養(yǎng)陰、活血通絡之功效，組方符合中醫(yī)防治DE 的基本原則， 具有中醫(yī) “治本” 的優(yōu)勢。 團隊前期臨床研究表明：益景湯對于改善DM患者眼部、心肌、腎臟微血管循環(huán)，保護相應臟器功能均有一定的療效［4-13］。

本研究結果顯示：①高血糖導致大鼠體質量明顯減輕，腦實質萎縮，大腦體積下降，益景湯可以改善這些癥狀，對大腦正常體積的維持作用尤為明顯；②高血糖導致大鼠腦組織缺血神經(jīng)元明顯增多，甚至出現(xiàn)神經(jīng)纖維纏結（神經(jīng)元的一種病理變化，與老年性癡呆相關），益景湯可以緩解高血糖導致的腦部缺血性變化，緩解腦萎縮，改善腦部血流灌注；③高血糖導致大鼠腦組織TGF－β1／Smads 信號通路的關鍵蛋白TGF－β1 和Smad4 表達升高，下游血管相關結構蛋白fibronectin 和collagenⅣ表達升高，claudin-5 表達降低，提示該通路是DM 腦微血管病變的發(fā)病機制之一。益景湯可以通過調(diào)節(jié)TGFβ1／Smads 信號通路相關蛋白的表達異常，保護細胞間的緊密連接，保護血管基底膜，對于維持腦微血管正常結構及功能有一定的效果。

綜上，益景湯能一定程度的改善早期DM 大鼠的消瘦和腦組織萎縮，并通過調(diào)節(jié)TGF-β1／Smads信號通路相關蛋白的表達，改善DM 大鼠早期腦微血管損害，改善腦部血流灌注。 對TGF-β1／Smads信號通路的調(diào)控可能是益景湯干預早期DM 腦微血管病變的作用機制之一。