微小RNA-1273g-3p 對人結(jié)直腸癌HCT116 和SW480 細胞增殖和遷移的影響#

李朝輝 劉大威 夏添明 孫生安 王云帥

（鄭州大學(xué)附屬洛陽市中心醫(yī)院胃腸外科，河南 洛陽 471000）

結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是胃腸道常見的惡性腫瘤之一，隨著生活方式的改變和環(huán)境等因素的影響，其發(fā)病率有逐年上升趨勢。結(jié)直腸癌患者早期癥狀不典型，導(dǎo)致多數(shù)患者確診時已是腫瘤晚期，造成治療延誤，病死率居高不下[1]。

微小RNA（MicroRNA，miR）是一種非編碼單鏈核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA），數(shù)量不多，但參與多種基因水平的調(diào)控，在機體生長發(fā)育、細胞分化、增殖、凋亡及腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[2-3]。研究表明miR-1273g-3p 在胰腺癌中高表達[4]，而本課題組既往研究顯示，miR-1273g-3p 在結(jié)直腸癌患者血清中也呈高表達，但是否具有促癌基因的作用未做研究。因此本文以結(jié)直腸癌HCT116 和SW480 細胞株為研究對象，以miR-1273g-3p 模擬物轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細胞，檢測miR-1273g-3p 對結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移的影響，以探究miR-1273g-3p 對結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人結(jié)直腸癌細胞株HCT116 和SW480（卓越創(chuàng)新中心）；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（Sigma）；LipofectamineTM 2000 Transfection Reagent、Opti-MEMTM（Ⅰnvitrogen）；Trizol 總RNA 提取試劑盒（天根）；miR-1273g-3p mimics 雙鏈及其陰性對照（上海吉瑪）；miR-1273g-3p 引物和U6 內(nèi)參引物（天根）；聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）相關(guān)試劑、反轉(zhuǎn)錄（Reverse Transcription，RT）試劑盒（天根）；噻唑藍（Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑盒（碧云天）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

以含10% FBS 的DMEM 在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)結(jié)直腸癌細胞HCT116 和SW480。

1.2.2 過表達miR-1273g-3p 瞬時轉(zhuǎn)染

以100 nM Lip2000 將miR-1273g-3p 模擬物瞬時轉(zhuǎn)染HCT116 和SW480 細胞，獲得miR-1273g-3p 過表達的細胞。用未行轉(zhuǎn)染處理的HCT116 和SW480 細胞分別做對照。在DMEM（含10% FBS）培養(yǎng)基、37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h。

1.2.3 PCR 檢測miR-1273g-3p 表達采用Trizol 法提取細胞總RNA，以紫外光分光光度計A260/A280 檢測RNA 濃度。采用miRcute 增強型miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒，在42℃ 60 min（miRNA 加A 尾反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），95℃ 3 min（酶失活反應(yīng)）條件下進行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。RT-PCR 采用miRcute 增強型miRNA 熒光定量檢測試劑盒（購自天根生化科技（北京）有限公司）。PCR 反應(yīng)以U6 為內(nèi)參，在95℃ 15 min 1 cycle，94℃ 20 s、60℃ 34 s 40 cycle 條件下反應(yīng)。相應(yīng)的引物見表1。實驗結(jié)果采用2-ΔΔCt法分析。

表1 引物序列

1.2.4 MTT 法檢測細胞生長

收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，鋪板于96 孔平底板使待測細胞密度在103-104/孔，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下孵育，待細胞單層鋪滿板底，加入0.5%MTT 溶液20 μL，每孔設(shè)置3 復(fù)孔，同時設(shè)置調(diào)零孔和對照孔。繼續(xù)孵育4 h 后，小心棄上清液，每孔加入DMSO 200 μL，低速震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標儀在 630 nm 波長處測量并記錄每孔的光密度（Optical density，OD）值。

1.2.5 Transwell 檢測細胞遷移能力

將細胞撤血清饑餓12-24 h 后消化并重懸細胞，細胞計數(shù)調(diào)整細胞密度5×105。取200 μL 細胞懸液加入transwell 上室，下室加入5%FBS 培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。取出小室，用棉簽將上層小室內(nèi)細胞輕輕擦拭干凈，用4%IFA（多聚甲醛）將下室細胞固定30 min，PBS 漂洗2 次后用1%結(jié)晶紫染色20 min，水洗后于顯微鏡下拍照計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差（±SD）表示，組間比較采用t檢驗，以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MiR-1273g-3p 經(jīng)轉(zhuǎn)染后在HCT116 和SW480細胞中的表達

聚合酶鏈反應(yīng)檢測miRNA-1273g-3p 表達顯示，轉(zhuǎn)染miRNA-1273g-3p 模擬物后，HCT116 和SW480 細胞中miRNA-1273g-3p 的相對表達量與對照組比較明顯提高（P＜0.01），見圖1；證明轉(zhuǎn)染成功，外源性 miR-1273g-3p 在結(jié)直腸癌HCT116 和SW480 細胞中穩(wěn)定表達。

圖1 miRNA-1273g-3p 的相對表達量

2.2 過表達miR-1273g-3p 對HCT116 和SW480細胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染miR-1273g-3p 模擬物72h 后，過表達組中HCT116 和SW480 細胞增殖比例明顯高于對照組（P<0.01），見圖2。

圖2 過表達miR-1273g-3p 對HCT116 和SW480 細胞增殖的影響

2.3 過表達miR-1273g-3p 對HCT116 和SW480細胞遷移的影響

轉(zhuǎn)染miR-1273g-3p 模擬物72 h 后，過表達組中HCT116 和SW480 細胞數(shù)明顯高于對照組（P<0.01），表3 和圖3。

圖3 過表達miR-1273g-3p 對HCT116 和SW480 細胞遷移的影響

表3 過表達miR-1273g-3p 對HCT116 和SW480 細胞遷移的影響（±SD，n=3）

表3 過表達miR-1273g-3p 對HCT116 和SW480 細胞遷移的影響（±SD，n=3）

注：與對照組相比，**P＜0.01。

組別 細胞數(shù)量HCT116 SW480未轉(zhuǎn)染組 445.00±20.298 404.00±19.519轉(zhuǎn)染組 843.67±23.007** 827.67±27.006**

3 討論

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，近十年來結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐漸上升[5]。開展結(jié)直腸癌相關(guān)分子機制研究，尋找新的治療靶點、分子標志物等，對改善結(jié)直腸癌患者的生存預(yù)后具有極其重要的臨床意義和社會價值。

目前研究表明，miRNA 異常表達在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中具有重要作用，有望成為腫瘤治療的新方向[6-8]。

在卵巢癌中，miR-1273g-3p 可以調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-a（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、α1-Ⅰ型膠原基因（Type α1-Ⅰ collagen gene，COL1A1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（Matrix metalloproteinase 2，MMP-2 ）、 基 質(zhì) 金 屬 蛋 白 酶-9 （ Matrix metalloproteinase 9，MMP-9）等基因的表達水平，同時可作為化療后復(fù)發(fā)性上皮性卵巢癌診斷的預(yù)后生物學(xué)標志物[9]。

長鏈非編碼RNA （Long non-coding RNA，LncRNA）RP11-279C4.1 通過調(diào)節(jié)miR-1273g-3p/色素框同源物3（Chromobox homolog 3，CBX3）軸來增強膠質(zhì)瘤細胞的惡性行為[10]。而miR-1273g-3p 對結(jié)直腸癌細胞功能的影響及機制目前尚不清楚。

本研究首先通過RT-PCR 發(fā)現(xiàn)miR-1273g-3p在HCT116 細胞和SW480 細胞中高表達；接著通過miR-1273g-3p模擬物轉(zhuǎn)染使HCT116和SW480細胞過表達miR-1273g-3p 發(fā)現(xiàn)，miR-1273g-3p 能促進HCT116 細胞和SW480 細胞的增殖和遷移。這說明miR-1273g-3p 在結(jié)直腸癌中可能起著促癌作用。但我們的研究沒有檢測miR-1273g-3p 水平下調(diào)對結(jié)直腸癌細胞的增殖和遷移能力的影響。且 miR-1273g-3p 對結(jié)直腸癌細胞 HCT116、SW480 細胞功能的影響的具體分子機制目前尚不明確，這是后續(xù)進一步研究的方向。本研究的對象是結(jié)直腸癌細胞，進一步可以研究miR-1273g-3p 表達情況與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系，進一步探究miR-1273g-3p 在結(jié)直腸癌中的作用。

總之，本研究結(jié)果顯示miR-1273g-3p 可能具有促進結(jié)直腸癌細胞HCT116、SW480 的增殖和遷移能力，從而在結(jié)直腸癌細胞中起促癌因子的作用。為進一步研究miR-1273g-3p 在結(jié)直腸癌中的作用機制提供了一定基礎(chǔ)。