miR-29及靶基因IFN-γ對痰菌陰性肺結核的診斷價值分析

李陽 蘆迪

結核病是由結核分枝桿菌感染引起的，是主要通過呼吸道傳播的慢性傳染性疾病，已受到全球各國的關注，也是我國重點控制的疾病之一[1]。在全球30 個結核病高負擔國家中，我國排名第二，如何進一步提高結核病的診治水平已成為臨床醫生重點關注的問題之一[2]。結核病防治的原則為早發現、早治療，但不少肺結核患者因排菌少，導致痰檢陰性，影響臨床診斷[3]。報道指出，miR-29 可調節T 細胞分化，在病原體感染和機體抗感染免疫反應中發揮了重要作用[4]。而miR-29 與結核病的發病及病情進展密切相關，IFN-γ 是其靶基因[5]。因此，本研究通過探討miR-29 及靶基因IFN-γ 在痰菌陰性肺結核的表達水平，分析其對痰菌陰性肺結核的診斷價值，為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象選取2018年3月～2019年3月我院收治的痰菌陰性肺結核患者200 例（痰菌陰性組），痰菌陽性肺結核患者200 例（痰菌陽性組），另選取健康體檢人員200 例作為對照組。痰菌陰性肺結核患者納入標準：①均按結核分枝桿菌痰涂片陽性或培養陽性確診；②符合菌陰活動性肺結核診斷標準[6]；③患者病情穩定；④無意識障礙。痰菌陽性肺結核患者納入標準：痰標本涂片鏡檢結果均顯示抗酸桿菌陽性，其余與痰菌陰性肺結核診斷標準相同。排除標準：既往結核病患者；精神疾病患者；研究中途退出者；妊娠期女性。痰菌陰性組，男124例，女76 例，年齡18～69 歲，平均（42.63±7.57）歲；痰菌陽性組，男119 例，女81 例，年齡20～70 歲，平均（41.98±7.86）歲；對照組，男131 例，女69 例，年齡19～71 歲，平均（43.63±8.12）歲。三組一般資料對比，差異無統計學意義（P>0.05）。

1.2 研究方法取患者早晨空腹靜脈血10ml，進行EDTA 抗凝，并加入淋巴細胞分離液5ml，400g 離心30min，然后吸取中層單核細胞，以磷酸鹽緩沖溶液重懸。以磁性活化細胞分選法對CD4+細胞進行篩選，TRIzol 裂解細胞。以酚氯仿對總RNA進行抽提，然后以分光光度計對其RNA 質量進行測定，并以瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。反轉錄為cDNA。miR-29:①逆轉錄反應，16℃ 30min，42℃40min，85℃ 5min；②熒光定量PCR，95℃預變性10min，95℃變性10s，60℃退火60s，40 個循環。靶基因IFN-γ：①逆轉錄反應，30℃ 10min，42℃30min；②熒光定量PCR，90℃預變性1min，55℃變性1min，72℃退火1min，30 個循環，然后72℃延伸10min。最后以U6RNA 作為內參基因，利用2-ΔΔCt法計算各樣本中miR-29a、miR-29b、miR-29c、靶基因IFN-γ mRNA 的表達量。引物序列見表1。

表1 miR-29a、miR-29b 、miR-29c 及靶基因IFN-γ的引物序列

1.3 統計學分析使用SPSS 24.0 對本研究中的數據進行處理，計量資料用±s表示，采用t檢驗或方差分析，P<0.05 時認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組miR-29a、miR-29b、miR-29c、IFN-γmRNA水平比較痰菌陽性組和痰菌陰性組的miR-29a、miR-29b、miR-29c 和IFN-γmRNA 水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）。痰菌陰性組和痰菌陽性組的miR-29a、IFN-γmRNA 水平均較對照組低，miR-29b、miR-29c 水平均較對照組高，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 三組miR-29a、miR-29b、miR-29c、IFN-γmRNA 的水平比較（±s）

表2 三組miR-29a、miR-29b、miR-29c、IFN-γmRNA 的水平比較（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05

組別 miR-29a miR-29b miR-29c IFN-γmRNA對照組（n=200） 0.86±0.23 0.93±0.25 0.83±0.21 1.00±0.02痰菌陽性組（n=200） 0.51±0.12* 2.61±0.87* 2.68±0.92* 0.16±0.07*痰菌陰性組（n=200） 0.49±0.10* 2.52±0.81* 2.59±0.88* 0.16±0.05*

2.2 miR-29a、miR-29b、miR-29c 和IFN-γmRNA對痰菌陰性肺結核診斷價值的比較ROC 曲線分析結果顯示，miR-29a、miR-29b、miR-29c 和IFN-γmRNA 診斷痰菌陰性肺結核的AUC 分別為0.872、0.859、0.864、0.896，靈敏度分別為84.0%、81.5%、83.0%、89.5%，特異度分別為93.0%、90.5%、92.0%、91.5%。見表3和圖1。

表3 miR-29a、miR-29b、miR-29c 和IFN-γmRNA 對痰菌陰性肺結核診斷價值的比較

圖1 miR-29a、miR-29b、miR-29c 和IFN-γmRNA 對痰菌陰性肺結核診斷價值的ROC 曲線

3 討論

近年來的流行病學研究結果顯示，我國結核病發病率總體呈逐年下降趨勢,但下降趨勢緩慢[7，8]。而大多數結核潛伏感染人群早期并無活動性結核的明顯臨床癥狀，存在進展為活動性結核的可能[9]。目前，結核病的常用診斷手段為影像學檢查及病原學檢查，但均存在一定的假陰性結果，這不利于結核病的防治[10，11]。因此，探討新的診斷方法對提高結核病的診斷水平具有重要意義。因此，本研究通過探討miR-29 及靶基因IFN-γ 在痰菌陰性肺結核的表達水平，為痰菌陰性肺結核的診斷提供參考依據。

miRNA 是一種單鏈小分子RNA，miR-29a、miR-29b 和miR-29c 均是其家族成員[12]。報道顯示miR-29 家族在機體免疫應答中發揮重要的作用，其靶基因相關蛋白通過抑制多個信號通路蛋白的表達而發揮調控作用[13]。且miR-29 是T 細胞因子或淋巴樣增強因子的負調控分子，通過降解靶基因IFN-γ 的表達能有效降低機體對胞內病原體的免疫應答水平[14]。

而在本研究中，痰菌陽性組和痰菌陰性組的miR-29a、miR-29b、miR-29c 和IFN-γmRNA 水平比較差異無統計學意義（P>0.05），但痰菌陰性組和痰菌陽性組的miR-29a、IFN-γmRNA 水平均較對照組低，miR-29b、miR-29c 水平均較對照組高，差異均有統計學意義（P<0.05）。一方面，由于IFN-γ 與抗結核感染免疫反應存在密切聯系，而無論是痰菌陽性和痰菌陰性的活動性肺結核患者，體內結核菌均呈活動狀態，所以其外周血特異抗原的效應T 細胞數量及免疫應答水平均可能類似[15，16]。而本研究結果中痰菌陽性和痰菌陰性肺結核患者IFN-γmRNA 水平差異并不明顯，也驗證了這一結論。另一方面也說明痰菌陽性和痰菌陰性肺結核患者與健康人群的miR-29a、miR-29b、miR-29c 和IFN-γmRNA 水平均存在明顯差異，miR-29a、miR-29b、miR-29c 和IFN-γmRNA 與肺結核的發生及發展可能存在密切的聯系[17]。經ROC 曲線分析結果顯示，miR-29a、miR-29b、miR-29c 和IFN-γmRNA 診斷痰菌陰性肺結核的AUC 分別為0.872、0.859、0.864、0.896，這提示miR-29a、miR-29b、miR-29c 和IFN-γmRNA 在痰菌陰性肺結核的診斷中均有重要的價值，也為結核病的診斷提供了重要的靶標和參考依據。

綜上，miR-29 及靶基因IFN-γ 與結核病的發生發展均存在密切聯系，測定miR-29a、miR-29b、miR-29c 及靶基因IFN-γmRNA 的表達水平對痰菌陰性肺結核的診斷具有重要價值。