丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對大鼠心肌細胞H9c2氧糖剝奪/復氧損傷模型的修復作用

蘇梅 婁雅靜 王姍 秦引林

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病簡稱冠心病，主要是由于冠狀動脈內(nèi)脂肪沉積、斑塊形成，導致血管狹窄、阻塞，促使心肌缺氧缺血甚至壞死[1]。冠心病患者發(fā)病時，會因心肌急劇的暫時或持續(xù)性缺血、缺氧誘發(fā)心絞痛和心肌梗死等癥狀。臨床上通常對最佳藥物治療有抵抗的患者進行經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI），以解除冠心病患者冠狀動脈狹窄、堵塞，恢復缺血區(qū)心肌組織的供血[2]。但由于缺血器官內(nèi)代謝、供需的不平衡會導致嚴重的組織缺氧和微血管功能障礙，且PCI 治療后的再灌注會進一步增強先天性和適應性免疫應答并激活細胞程序性死亡，加重組織損傷和炎癥反應，這一現(xiàn)象稱為缺血再灌注損傷[3，4]。丹參為唇型科植物丹參的干燥根和根莖，常用于活血化瘀，通經(jīng)止痛。丹參酮ⅡA是丹參提取物中最豐富、結(jié)構(gòu)最具有代表性的活性化合物，具有擴血管、抗氧化、抗炎和降低血液黏滯度等作用[5～7]。丹參酮ⅡA 經(jīng)磺化后更穩(wěn)定，起效更快，更適合臨床使用。本研究通過觀察丹參酮ⅡA磺酸鈉（STS）注射液對大鼠心肌細胞氧糖剝奪/復氧（OGD/R）的作用效果，初步驗證STS 注射液對心肌缺血再灌注損傷的預防和修復作用。

1 材料與方法

1.1 細胞和鑒定大鼠心肌細胞H9c2 經(jīng)過復蘇后，利用抗橫紋肌肌動蛋白抗體（anti-Sarcomeric α-actinin，ab68167，abcam）進行免疫熒光染色鑒定。

1.2 主要實驗材料

1.2.1 細胞實驗主要材料 完全DMEM 培養(yǎng)基（凱基生物，KGM12800S）；DMEM w/o Glucose（Gibco，11966025）；胰蛋白酶-EDTA 消化液（Solarbio，T1300）；1×PBS（0.01M，pH7.4）（凱基生物，KGB 5001）；FBS（Gibco，10099-141）；CCK-8 法：細胞增殖檢測試劑盒（凱基生物，KGA317）；葡萄糖（阿拉丁，G107850）；STS 注射液（上海醫(yī)藥，2005310）；H9c2 細胞（武漢普諾賽，CL-0089）。

1.2.2 檢測實驗所用材料 Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit（AP101-100-kit，MULTI SCIENCES 聯(lián)科生物）；CCK8 細胞增殖檢測試劑盒（KGA317，凱基生物）；改良Masson 三色染色液（G1345，Solarbio）；中性樹脂（CW0136，CWBIO）；PCNA Polyclonal antibody（anti-PCNA,10205-2-AP，Proteintech）；Cardiac Troponin T Polyclonal antibody（anti-cTnT，15513-1-AP,Proteintech）；Goat Anti-Rabbit IgG-Cy3（As007，ABclonal)；Goat Anti-Rabbit IgG-FITC（cw0114s，CWBIO）；即用型DAPI 染液(KGA215-50，凱基生物)。

1.3 主要儀器設(shè)備

1.3.1 細胞實驗主要儀器設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司，BPN-80CW）；倒置熒光顯微鏡（廣州市明美光電有限公司，MF53）；潔凈工作臺（BIOBASE，BBS-SDC）；醫(yī)用離心機（長沙英泰儀器有限公司，TD4A）；酶標儀（北京六一生物科技有限公司，WD-2102B）；三氣培養(yǎng)箱（長沙華曦電子科技有限公司，YCP-10S）。

1.3.2 檢測相關(guān)實驗主要儀器設(shè)備 旋渦混合器(XH-C，常州越新儀器制造有限公司）；低溫高速離心機（TGL-16D，常州中捷實驗儀器制造有限公司）；NovoCyteTM流式細胞儀[NovoCyte 2060R，艾森生物（杭州）有限公司]；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9054，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）；顯微鏡（BX43，OLYMPUS）。移液槍（Research plus 0.5～10μl，eppendorf）；移液槍（Research plus 20～200μl，eppendorf）；移液槍（Research plus 100～1 000μl，eppendorf）；高壓鍋(YS20ED，蘇泊爾)。

1.4 實驗方法

1.4.1 藥物配制 葡萄糖：稱取葡萄糖粉末1.8g，加入10ml 無菌去離子水，溶解得到1M（180g/L）母液，1ml 完全培養(yǎng)基中加入25μl 葡萄糖母液，得到濃度為4.5g/L 的溶液。

STS 注射液：5mg/ml 的注射液中STS 濃度為12.6μmol/ml，向1ml 注射液中加入0.26ml 無菌去離子水得到10μmol/ml 母液，根據(jù)不同工作濃度進行稀釋即可。

1.4.2 實驗分組 ①正常細胞組（常規(guī)培養(yǎng)不加干預）；②模型組（OGD/R 6h/18h）；③模型+低濃度STS 處理組（OGD/R+5μM STS）；④模型+中濃度STS 處理組（OGD/R+10μM STS）；⑤模型+高濃度STS 處理組（OGD/R+15μM STS）。

1.4.3 細胞實驗操作 傳代與鋪板：棄去細胞培養(yǎng)上清液，用1×PBS 洗兩遍，加入0.25%胰酶（含0.02%EDTA）消化，待細胞變圓后加入培養(yǎng)基終止消化并收集細胞懸液至10ml 離心管中，1 000rpm 離心3min，棄去上清液加入培養(yǎng)基重懸細胞；24 孔板每孔鋪細胞3×104個，培養(yǎng)基體積為500μl；6 孔板每孔鋪細胞5×105個，培養(yǎng)基體積為1.5ml 待細胞完全貼壁后進行藥物處理和OGD/R 造模。

細胞藥物處理與造模：將模型組、模型+STS 處理各組細胞使用PBS 洗滌2 遍，加入不完全DMEM培養(yǎng)基，模型+STS 處理組分別加入STS 5μM、10μM、15μM，放置在三氣培養(yǎng)箱中缺氧處理（缺氧條件：1%氧氣+5%CO2+94%N2），6h 后進行復氧、復糖處理，18h 后進行流式凋亡、免疫熒光、Masson 檢測。

1.4.4 細胞活性檢測（CCK-8 檢測） 待細胞密度約80%～90%時，將細胞進行消化、重懸、計數(shù)、鋪板，待細胞貼壁后，加入不同濃度的STS 處理24h，將待測的96 孔板細胞換成相同的培養(yǎng)基，每孔100μl；每孔加入10μl CCK-8 試劑，置于培養(yǎng)箱中孵育2h；酶標儀在450nm 波長處檢測每孔的吸光值。

1.4.5 流式檢測凋亡 按照實驗分組處理細胞后，消化并收集細胞，加入1ml PBS 后1 500rpm 離心3min，再用PBS 洗2 遍。用雙蒸水將5×Binding Buffer 稀釋為1×Binding Buffer。取300μl 預冷的1×Binding Buffer 重懸細胞。每管各加入3μl Annexin V-FITC 和5μl PI-PE 或3μl Annexin V-APC 和5μl 7-ADD。輕微混勻后，室溫避光孵育10min。再向每管中加入200μl 預冷的1×Binding Buffer。混勻后上流式細胞儀檢測。

1.4.6 細胞Masson 染色 將細胞去上清后做常規(guī)固定，切片浸入Bouin 液，置于溫室過夜進行媒染，蒸餾水沖洗至切片上的黃色消失。使用天青石藍染液滴染3min 后稍水洗，再用Mayer 蘇木素染色液滴染3min 后稍水洗，隨后用酸性乙醇分化液分化數(shù)秒，流水沖洗10min。加入麗春紅品紅染液滴染10min，蒸餾水稍沖洗。再用磷鉬酸溶液處理10min。棄去上清，切片不用水洗，直接滴入苯胺藍染液染5min。隨后用弱酸溶液處理2min。染完色后用95%的乙醇快速脫水。無水乙醇脫水3 次，每次10s。用二甲苯透明3 次，每次2min。最后用中性樹脂封固。

1.4.7 細胞免疫熒光雙染 細胞固定：在培養(yǎng)板中將已爬好細胞的培養(yǎng)皿用PBS 浸洗3 次，每次3min；用4%的多聚甲醛固定15min，PBS 浸洗培養(yǎng)皿3次，每次3min；細胞通透：0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫通透20min。封閉：PBS 浸洗培養(yǎng)皿3次，每次5min，移液槍吸干PBS，在培養(yǎng)皿上滴加5%BSA，37℃封閉30min。一抗孵育：移液槍吸掉封閉液，不洗，每個培養(yǎng)皿滴加足夠量的、稀釋好的一抗anti-cTnT（1∶200），4℃孵育過夜；加熒光二抗:PBS 浸洗培養(yǎng)皿3 次，每次3min，移液槍吸干培養(yǎng)皿內(nèi)多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗Goat Anti-Rabbit IgG-Cy3（1∶100），37℃孵育30min，PBS浸洗培養(yǎng)皿3 次，每次3min；從加熒光二抗起，后面所有操作步驟盡量在較暗處進行;二次封閉：PBS浸洗培養(yǎng)皿3 次，每次5min，移液槍吸干PBS，在培養(yǎng)皿內(nèi)滴加5%BSA，37℃封閉30min。一抗孵育：移液槍吸掉PBS，每個培養(yǎng)皿內(nèi)滴加足夠量的、稀釋好的一抗anti-PCNA（1∶200），37℃孵育3h。加熒光二抗：培養(yǎng)皿復溫至室溫后，PBS 浸洗培養(yǎng)皿3 次，每次5min，移液槍吸干培養(yǎng)皿內(nèi)多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗Goat Anti-Rabbit-FITC（1∶100），37℃孵育45min，PBS 浸洗切片3 次，每次5min；復染核：滴加DAPI 避光孵育5min，對標本進行染核，用PBS 浸洗多余的DAPI；封片：用20%甘油封閉培養(yǎng)皿，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。染色結(jié)果判讀：FITC 綠色熒光指示PCNA 定位，Cy3 紅色熒光為cTnT 定位，藍色熒光為細胞核。

1.5 數(shù)據(jù)分析所得數(shù)據(jù)用 GraphPad Prism 軟件作圖，采用SPSS 19.0 軟件包進行處理，以均數(shù)±標準差（±s）表示，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞鑒定凍存的大鼠心肌細胞H9c2 經(jīng)過復蘇和培養(yǎng)后，利用特異性抗體anti-Sarcomeric α-actinin 進行免疫熒光鑒定。檢測其胞內(nèi)橫紋肌肌動蛋白表達量。結(jié)果如圖1所示，在不同視野下細胞生長形態(tài)均正常，胞內(nèi)有特異性的橫紋肌肌動蛋白表達且呈現(xiàn)典型的細胞骨架樣分布。

圖1 免疫熒光檢測大鼠心肌細胞H9c2 橫紋肌肌動蛋白的表達和分布

2.2 藥物處理細胞的適宜濃度范圍在所培養(yǎng)的細胞中加入不同濃度的STS，以摸索藥物處理細胞適合的濃度范圍。結(jié)果表明，STS 濃度≤15μM 時未出現(xiàn)對細胞活力的顯著干擾，但是隨著藥物濃度的增加，在20μM 時細胞活力呈下降趨勢（P<0.05）。因此確定藥物的適宜處理濃度≤15μM，見圖2。

圖2 CCK-8 法檢測各濃度STS 處理后細胞的活力變化

2.3 不同濃度STS 對細胞OGD/R 模型的藥效在確定了STS 的適宜處理濃度后，在處理組中設(shè)置了5μM、10μM 和15μM 3 個濃度。細胞在無糖培養(yǎng)基中孵育并加入上述濃度的藥物后，置于三氣培養(yǎng)箱模擬低氧環(huán)境（1%O2+5%CO2+94%N2）培養(yǎng)6h。在1.5ml 的培養(yǎng)基體系中補充150μl FBS 和37.5μl 葡萄糖（1M），并置于常規(guī)CO2培養(yǎng)箱以實現(xiàn)復糖復氧培養(yǎng)，從而建立細胞糖氧剝奪后復氧復糖所造成的損傷模型。經(jīng)過18h 的常規(guī)培養(yǎng)后，利用細胞凋亡檢測試劑盒對細胞染色，并利用流式分析儀檢測細胞的凋亡率。結(jié)果如圖3所示，正常組細胞的自然凋亡率為8.59%，模型組的細胞凋亡率為52.87%。表明經(jīng)過氧糖剝奪和復氧復糖之后，細胞出現(xiàn)了顯著的損傷，模型構(gòu)建成功。在3 個處理組中，不同濃度的STS 均能顯著下調(diào)細胞的凋亡率，且與藥物處理濃度呈現(xiàn)劑量依賴的趨勢，表明經(jīng)過STS 處理后能顯著預防因氧糖剝奪和復氧復糖所造成的細胞損傷，其中以15μM 的STS 濃度處理細胞后效果最好，凋亡率為12.1%。

圖3 流式儀檢測不同濃度STS 對OGD/R 模型中細胞凋亡的抑制效果

2.4 Masson 染色檢測在使用上述藥物濃度處理細胞后，利用Masson 染色來檢測經(jīng)造模和藥物干預后細胞形態(tài)和纖維化的程度。染色結(jié)果如圖4所示，分別選取3 個視野觀察。結(jié)果表明正常組細胞Masson 染色后主要呈現(xiàn)藍色，說明其膠原纖維居多，模型組染色后呈紅色，為肌纖維，不同濃度STS 處理后與模型組比較其紅色減弱，表明STS 能一定程度地減輕細胞因造模導致的纖維化。

圖4 Masson 染色檢測心肌細胞形態(tài)和纖維化程度

2.5 免疫熒光檢測胞內(nèi)PCNA 和cTnT 表達量在各組細胞中均能檢測到PCNA 和cTnT 的表達。但是細胞經(jīng)過OGD/R 造模后密度顯著降低，其胞內(nèi)的PCNA 和cTnT 免疫熒光染色信號也有所減弱。經(jīng)過不同濃度的STS 處理后，細胞密度有所升高，細胞形態(tài)也有所改善（見圖5）。通過對免疫熒光信號強度分析，OGD/R 造模后細胞的PCNA 表達量有所降低，但是經(jīng)過15μM 的STS 處理后其表達量顯著上調(diào)(P=0.005)。OGD/R 造模后，細胞的cTnT 表達量降低，經(jīng)10μM 的STS 處理后，其表達量顯著上調(diào)（P=0.013）（見圖6）。

圖5 免疫熒光雙染檢測細胞內(nèi)PCNA 和cTnT 表達量變化

圖6 定量分析免疫熒光雙染檢測細胞內(nèi)PCNA 和cTnT 表達量變化

3 討論

冠心病的發(fā)作往往是由于冠狀動脈內(nèi)斑塊的侵蝕或易損斑塊的破裂，使動脈粥樣硬化斑塊的脂質(zhì)核心中高度促凝成分暴露于循環(huán)的血小板和凝血蛋白中，最終導致冠狀動脈內(nèi)血栓形成[8]。冠心病早期治療可以降低心肌損傷的程度。因此，快速診斷和早期治療是冠心病治療的中心原則[9]。由于疾病會損害細胞膜的完整性，心肌壞死伴隨著結(jié)構(gòu)蛋白和其他細胞內(nèi)大分子向心臟間質(zhì)的釋放。心肌壞死的生物標志物包括心肌肌鈣蛋白I 和T（cTnI和cTnT）、肌酸激酶、肌紅蛋白、乳酸脫氫酶。其中，cTnT 是檢測心肌損傷的首選生物標志物。研究表明，cTnT 濃度升高不僅與病變的程度、心肌組織受損有關(guān)，還與血管成形術(shù)中不良預后有關(guān)[10]。臨床上cTnT 的檢測有助于早期排除心肌梗死[11]。PCNA 是存在于增殖細胞中且呈階段性表達的蛋白質(zhì)。PCNA 表達增強，常常代表著DNA 復制和修復[12]。本研究中對PCNA 和cTnT 的檢測能夠反映STS 對心肌細胞損傷的保護和修復作用。

本研究采用了惰性氣體N2對大鼠心肌細胞H9c2 造模，體外模擬冠心病、心肌梗死等治療后產(chǎn)生的心肌缺血再灌注損傷，該造模方法操作簡單易復制，較為環(huán)保[13]。此模型可以直接觀察STS 對細胞凋亡的抑制、生長形態(tài)等方面的影響，從OGD/R模型組可以看出心肌細胞H9c2 經(jīng)過OGD/R 后，細胞凋亡、損傷以及纖維化明顯，可廣泛用于該類試驗的造模，此與既往研究相一致[14～16]。

STS 注射液是主要成分為STS 的紅色澄明液體，STS 是丹參酮ⅡA 經(jīng)磺化后得到的衍生物，改善了丹參酮ⅡA 水溶性和生物利用度較低的缺陷[17]。研究表明，STS 能夠降低患者的QT 離散度，提高左室射血分數(shù)，從而改善患者的心功能，降低心肌梗死再灌注治療患者室性心律失常的發(fā)生率[18]。還能通過抑制心肌細胞增生、降低膽固醇的含量、提高NO含量、抗炎等作用有效緩解心絞痛等癥狀[19]。從本實驗結(jié)果可看出，10μM 和15μM 濃度的STS 能顯著預防和改善由造模所引起的細胞凋亡和形態(tài)異常，顯著上調(diào)細胞內(nèi)cTnT 和PCNA 表達水平。發(fā)生心肌梗死和心絞痛的時候，由于缺血缺氧等原因，持續(xù)的細胞壞死和凋亡共同主導患者心肌細胞的死亡過程[20]。而STS 能夠促進OGD/R 模擬的心臟梗死后仍有活力的心肌細胞增殖來改善心臟功能。

本研究通過驗證STS 對OGD/R 細胞的保護作用，進一步證明了STS 治療冠心病、心絞痛等疾病的有效性，并為臨床用藥提供數(shù)據(jù)支持。但后續(xù)仍需做深入研究，探討可能的作用機制。