響應面法優化余甘子種質資源ISSR反應體系

王建超 何銀鶯 黃旭萍 沈朝貴 陳發興 郭林榕

摘要：【目的】優化余甘子種質資源ISSR-PCR反應體系，為余甘子種質資源遺傳多樣性及親緣關系研究提供基礎。【方法】以緬甸、印度、廣東、云南、福建等5份來源小同的余甘子種質資源的基因組DNA組成混合的DNA模板，綜合單因素試驗和響應面分析法，分析引物濃度、2×Taq Master Mix添加量、DNA模板量、退火溫度等反應條件對IS SR-PCR反應體系的影響，優化建立余甘子IS SR-PCR反應體系?！窘Y果】引物濃度和2×Taq MasterMix添加量對擴增效果有較大影響，DNA模板量影響較小;引物濃度和DNA模板量交互作用明顯;余甘子ISSR反應體系為引物濃度0.4 umol L-l，2×Taq Master Mix添加量l3 uL， DNA模板量30 ng，擴增結果與響應面分析模型理論值相對誤差儀為9.39%;退火溫度為50.5- 52.7℃時，隨著溫度的升高，條帶質量變好，數量變多，退火溫度為52.7℃時可獲得多樣性好的清晰條帶?！窘Y論】獲得ISSR-PCR反應體系為引物濃度0.4 umoI·L-1，2×Taq MasterMix添加量13 UL， DNA模板量30 ng，退火溫度52.7℃，擴增循環數35循環，擴增獲得的條帶清晰、穩定，多樣性好，該體系適于余甘子種質資源的遺傳多樣性和親緣關系等分析研究

關鍵詞：余甘子;ISSR-PCR;響應面;體系優化

中圖分類號：S 682.310.36

文獻標志碼：A

文章編號：1008-0384（ 2021） 07-075907

Response Surface Optimization of ISSR-PCR Reaction for Genetic Study on

Phyllanthus Emblica

WANG Jianchao1.2. HE Yinying2. HUANG Xuping2， SHEN Chaoguj1， CHEN Faxing2. Guo Linrong1*

（l.Fruit Research Institute， Fujian Academy ofAgricultural Sciences. Fuzhou， Fujian 350013，China：

2.College ofHorticulture， Fujian Agriculture and Forestrv University. Fuzhou， Fujian 350002. China）

Abstract： 【Objective】 ISSR-PCR reaction system for genetic study on Phyllanthus emblica germplasms was optimized【Methods】 A mixed DNA template composed of genomic DNA ofP emblica germplasms came from Myanmar. India.Guangdong， Yunnan， and Fujian was obtained. The single factor test and response surface analysis were used to optimize theISSR-PCR reaction conditions including primer concentration. amount of 2×Taq Master Mix. DNA template amount， andannealing temperature.【Result】 The primer concentration and addition amount of 2×Taq Master Mix had a greater impacton the amplification than did the DNA template amount. A significant interaction between the primer concentration and DNAtemplate amount was found. The optimized system with a primer concentration of 0.4 ymoI·L-1.a 2×Taq Master Mix of13 UL， and a DNA template concentration of 30 ng was established that achieved a low relative error of 9.39% in predicting thetheoretical response. Within the annealing temperature between 50.5 ℃ and 52.7 ℃. increasing temperature improved thenumber and quality of bands. When the annealing temperature is 50.5-52.7.C，the number of strips increases. and the quality ofthe strips becomes better with the increase of temperature. The annealing temperature is 52.7℃to obtain good diversity andclear bands. 【Conclusion】 The optimized ISSR-PCR reaction system was established applying a primer concentration of0.4 umoI-L-1，a 2×Taq Master Mix ofl3L，aDNA template concentration of 30 ng at the annealing temperature of 52.7℃for35 amplification cycles. The methodology could be used to study the genetic diversity and relationship of P. emblicagermplasms .

1.3統計分析

采用Excel 2016、Design Expert 8.0.6等軟件進行統計分析，其中Design Expert 8.0.6進行響應面試驗設計、數據分析和模型的建立。

2結果與分析

2.1單因素對ISSR反應體系的影響

單因素試驗的擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2，可見，引物濃度與2×Taq Master Mix添加量對反應體系的影響較大。引物濃度偏高或偏低都會影響擴增結果，引物濃度過高會引起引物與DNA模板錯配和非特異性產物擴增，增加產生二聚體的概率，引物濃度偏低則不易測出擴增位點，本研究引物濃度為0.30～0.40 umol.L-l時電泳效果較好。2×Taq Master Mix含有Taq DNA聚合酶、dNTP混合物和Mg2+等反應原料，Taq DNA聚合酶直接影響擴增反應的成功與否，濃度過高容易產生非特異的PCR產物，dNTP是ISSR分子標記擴增的重要原料，濃度過高易錯配，過低影響合成效率，2×Taq MasterMix添加量為12～14 uL為最佳。DNA模板量范圍取決于物種基因組大小和DNA純度，研究表明，DNA模板量對余甘子ISSR-PCR的影響較小，考慮電泳條帶質量和數量，選擇DNA模板量最佳為30 ng。

2.2響應面法優化ISSR反應體系

以電泳圖譜（圖3）中電泳條帶數量、清晰度、重復性、亮度和背景干凈程度的評分（5名科研T作者主觀評分）為響應值（表4），采用多元回歸擬合，獲得引物濃度（X1），2×Taq Master Mix添加量（X2），DNA模板量（X3）的二次多項回歸模型為F=11.92-0.437 5X1-O.5 5X2 -1.737 5X2-0.75XIX21.575XIX3-0.55X2X3-4.2975Xl2-3.5225X2--2.1975X32。檢驗方程的有效性，對數學模型進行方差分析電泳圖評分為響應值時，該二次方程模型有統計學意義（p-0.012 6<0.05），說明該模型對本試驗有較好擬合;回歸方程失擬性檢驗無統計學意義（p-0.7571），表明未知因素對試驗結果干擾很小，模型能較好地反應真實的試驗值，可用于響應值的分析和預測，所得的回歸方程模型能較好地預測電泳圖譜得分隨各參數的變化規律。試驗所選三因子X1、X2和X3中X3達到顯著影響（p<0.05），Xl、X2因子二次項均達到極顯著影響（p<0.001）表明單因素X2對響應結果影響較大，且X1與X2因子有極顯著的交互影響。

根據回歸擬合方程得出各試驗因子引物濃度（X）、2×Taq Master Mix添加量（X2）、DNA模板量（X3）兩兩因素交互作用的等高線圖（圖4），等高線圖可直觀反映出2個變量間交互作用的顯著程度，其中圓形表示兩兩因素交互作用不顯著，而橢圓形表示兩兩因素交互作用顯著[16];等高線圖由藍到紅的變化越快，沿白變量方向高度差越大[17]，引物濃度（Xl）和DNA模板量（X3）之間交互作用顯著。

根據Design Expert 8.0.6軟件分析出的若干解決方案與其相應預測得分值，考慮到保證高響應值的同時節約成本，對響應面優化結果進行最優分析驗證，得到ISSR反應體系的實際值（圖5），該值與理論預測值進行比較計算相對誤差，結果見表5。結果表明，最優實際解決方案引物濃度為0.40 umol·L-1，2×Taq Master Mix添加量為13.0 uL，DNA模板量30 ng，該條件與理論預測響應值13.130 4的相對誤差僅為9.39%，說明該模型具有好的分析能力，可為實際操作提供良好的指導。

2.3退火溫度對ISSR反應體系的影響

退火溫度影響ISSR圖譜的穩定性，較低的退火溫度可保證引物與模板結合的穩定性，但較易產生錯誤的擴增。由電泳圖譜（圖6）可知，35循環數下，50.5～54.0℃隨著退火溫度的升高譜帶質量與條帶數有較明顯的變化，退火溫度為50.5—52.7℃時，隨著溫度的升高條帶數呈增加趨勢，條帶質量變好，52.7～54.0℃時，部分條帶模糊，缺失。選擇較高的退火溫度可減少引物和模板間非特異性的結合，提高擴增產物的特異性，綜合譜帶質量和條帶數，退火溫度為52.7℃時最佳，可獲得較好的擴增效果。

通過優化得到ISSR-PCR反應的體系為引物濃度為0.4 umol·1-1，2×Taq Master Mix添加量為13 uL，DNA模板量30 ng，退火溫度為52.7 0C，循環次數35次;將該體系應用于不同余甘子種質資源效果見圖7，引物UBC841在該體系下可擴增出條帶清晰和多態性良好的電泳圖譜，表明該體系適宜應用于余甘子種質資源的遺傳多樣性和親緣關系研究。

3討論與結論

ISSR是在SSR的基礎上發展起來的一種新型的分子標記，目前，ISSR已廣泛用于植物品種鑒定、遺傳圖譜、遺傳多樣性及分子生態學研究[18.19]。ISSR分子標記技術基于PCR反應，其擴增譜帶受反應條件和擴增程序變化以及物種不同的影響，采用不同的反應體系組合和擴增程序電泳結果差異較大，因此，開發ISSR分子標記對其反應體系和擴增程序優化顯得必不可少。

本研究綜合運用單因素試驗與響應面分析法，首先確定了各因素的有效范圍，再對各因素組合優化，從而確立普遍適用于余甘子種質資源的ISSR-PCR反應體系。本研究PCR擴增采用2×Taq MasterMix試劑，該試劑將多種擴增原料混合，研究結果雖未能直觀體現Taq DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+等原料對余甘子ISSR-PCR反應體系的影響[20]，但可大大提高T作效率，達到了節省物料、簡便、快速的目的，可在ISSR分子標記研究中加以推廣應用。本研究結果表明引物濃度對余甘子ISSR反應體系影響較大，DNA模板量與引物濃度有顯著的交互作用，與前人研究較一致[21.22]。應用響應面法對影響ISSR反應體系的主要因素進行篩選，建立余甘子ISSR反應體系模型F=11.92-0.437 5X1-0.55X2 1.737 5X30.75XIX2 1.575X1X3 0.55X2X3 4.297 5Xl2 3.522 5X222.197 5X22，可較快地得到最優組合，避免了單因素試驗結果的不足。

本研究確立余甘子ISSR-PCR反應體系：引物濃度為0.4 UMol·1，2×Taq Master Mix添加量為13 UL，DNA模板濃度30 ng，擴增循環數為35循環，退火溫度52.7℃;擴增獲得的條帶清晰、穩定，多樣性好，可應用于余甘子種質資源的遺傳多樣性分析和親緣關系研究。

參考文獻：

[1]潘慧清，朱平，魏學明，等藏藥余甘子研究概[J]。甘肅中醫藥大學學報，2019，36 （2）：8488

PAN H Q，ZHU P， WEI X M，et al On Tibetan medicine Yuganzi（Phylianthi fructus） [Jl Journal of Gansu University of ChineseMedicine. 2019. 36（2）：8488.（ in Chinese）

[2] 國家藥典委員會中華人民共和國典一部[M]北京：中國醫藥利技出版社、2020 186-187

[3] 趙謀明，劉曉麗，崔春，等余甘子多酚響應面法優化提取及其抗氧化活性研究[J]食品工業科技，2007. 28 （6）：117-120

ZHAO M M. LIU X L，CUI C，et al.Studv on the optimizingextraction processing of polyphenol from Phyllanthus emblicaL fruitby method of response surface analvsis and its antioxidant activity [J]Science and Technology of Food Industry， 2007. 28（6）：117-120（ in Chinese）

[4] GANTAIT s，MAHANTA M. BERA s，et al Advances iiibiotechnology of Emblica officinalis Gaertn. syn. Phyllanthus emblicaL：A nutraceuticals-rich fruit tree with multifaceted ethnomedicinaluses [J]3 Biotech. 2021. 11 （2）;1-25

[5] ZIETKIEWICZ E，RAFALSKI A. LABUDA D Genomefmgerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerasechain reaction amplification [J] Genomics. 1994. 20（2）：176-183

[6] SARWAT M. DAS s，SRIVASTAVA P s Analysis of geneticdiversity through AFLP. SAMPL. ISSR and RAPD markers iiiTribulus terrestris.a medicinal herb [J]. Plant Cell Reports， 2008.27 （3） 519528

[7] 楊培奎，鄭道序，馬瑞君，等潮汕橄欖地方品種（系）遺傳多樣性的ISSR分析[J]廣東農業科學，2013. 40 （23）：129-132

YANG P K. ZHENG D X. MA R J，et al_ Genetic diversity analvsis ofCanarium olbumL landrances in Chaoshan area by ISSR[J]Guangdong .Agricultural Sciences. 2013. 40 （23）：129-132 （inChinese）

[8] 張安世，韓臣鵬，齊秀娟，等基于ISSR標記的獼猴桃品種遺傳多樣性分析及指紋圖譜構建[J]植物資源與環境學報，2017. 26 （3）：19-26

ZHANG A S，HAN C P，QI X J，et al Genetic diversity analvsis andfingerprinting construction of cultivars of Actinidio spp. based onISSR marker [J] Journal of Plant Resources and Environment. 2017，26 （3）：19-26 （in Chinese）

[9] 李國田，張美勇，相昆，等基于ISSR標記的16個核桃品種遺傳多樣性分析及分子身份構建[J].核農學報、2015. 29 （10）：1884-1892

LI G T，ZHANG M Y. XIANG K，et al Analysis of genetic diversityand establislunent of molecular ID for 16 walnut varieties based onISSR markers [Jl Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 2015.29（ 10）： 1884-1892. （in Chinese）

[IO]劉曉生，鄭道序，周春娟，等潮汕余甘子種質資源遺傳多樣性與親緣關系的ISSR分析[J]中國南方果樹，2014.43 （1）：1822

LIU X S，ZHENG D X，ZHOU C J，et al Analysis of genetic diversityand genetic relationship of Phyllonthus emblicaL Gerniplasin inChaoshan area with ISSR [J] South China Fruits. 2014. 43（1）：1822 （in Chinese）

[11]周春娟，詹潮安，劉曉生，等粵東余甘子種質資源遺傳多樣性與親緣關系的ISSR分析[C]//廣東省植物學會年會2012年年會論文集2012：16-16

ZHOU C J，ZHAN C A. LIU X S，et al ISSR Analysis of geneticdiversity and genetic relationship of Phyllanthus emblica germplasmresources in eastem Guangdong[C] //Annual meeting of GuangdongBotany Society. 2012： 16-16 （in Chinese）

[12]邵雪花，劉牛，賴多，等28份余甘子品種遺傳多樣性的ISSR分析及指紋圖譜構建[J]西北農林科技大學學報（自然科學版），2020.48 （8）：129-136

SHAO X H，LIU N. LAI D， et al Genetic diversity analysis and DNAfingerprint inapping of 28 varieties of Pbyllanthus emblicaL based onISSR molecular marker [J] Journol of Northivest A&f University（Natural Science Edition）， 2020. 48（8）：129-136（ln Chinese）

[13]李巧明，趙建立云南干熱河谷地區余甘子居群的遺傳多樣性研究[J]生物多樣性，2007. 15 （1）：8491

LI Q M. ZHAO J L Genetic diversity of Phyllanthus emblicopopulations in dry-hot valleys in Yunnan [J] Biodiversity Science.2007. 15（1）：8491. （in Chinese）

[14]李金璐，王碩，于婧，等 ‘種改良的植物DNA提取方法[J].植物學報.2013. 48 （1）：7278

LI J L，WANG S， YU J， et al A modified CTAB protocol for plantDNA extraction [J] Chinese Bulletin of Botany. 2013. 48（1）：7278. （in Chinese）

[15]尚小紅，嚴華兵，曹升，等葛根SCoT-PCR反應體系優化及引物篩選[J]南方農業學報，2018. 49 （1）：1-7

SHANG X H. YAN H B，CAO S，et al Optimization of SCoT-PCRreaction svstein and primer selection for Pueraria DC[J] Journal ofSoutbern Agriculture. 2018. 49（1）：1-7.（ in Chinese）

[16]闞琦繽，劉瑞雪，王曉婭，等響應面優化刺五加總黃酮提取工藝及

體外抗氧化研究[J].福建農業學報，2021. 36 （3）：358368

KAN Q B，LIU R X. WANG X Y. et al_ Process optimization and invitro antioxidant activity of flavonoids extracted from Acantbopanaxsenticosus [J] Fujian Journol ofAgricultural Sciences. 2021， 36 t3）I358368 （in Chinese）

[17]鄭良，李越凡，趙強，等基于響應面分析的聚甲基丙烯酸甲酯表面微觀生物污損超聲防除研究[J]表面技術，2021. 50 （4）：319327

ZHENG L，LI Y F，ZHAO Q，et al_Research on removal ofmicrofouling on polymethyl methacrylate surface by ultrasonicantifouling technology based on response surface analysis [Jl SurfaceTechnology. 2021. 50 （4）： 319327（in Chinese）

[18] YEH F c Population genetic analysis of codominant and doininantmarkers and quantitative traits [J] Belgion Journal of Botany. 1997：129

[19]王建波ISSR分子標記及其在植物遺傳學研究中的應用[J]遺傳，2002. 24 （5）：613616

WANG J B ISSR markers and their applications in plant genetics [JlHereditas（Beijing）. 2002， 24（5）：613616.（ in Chinese）

[20]黃曉慧，巫偉峰，陳春，等中國蘭ISSR-PCR反應體系優化及引物篩選[J]南方農業學報，2018. 49 （7）：1282-1288

HUANG X H. WU W F，CHEN C， et al Optimization and primerscreening of ISSR-PCR reaction system for Chinese Orchids [JlJournol of Southern .4griculture. 2018. 49（7） 1282-1288.（ inChinese）

[21]劉鳳書，侯開衛，李紹家，等余甘子的保健價值及開發利用前景[J]自然資源學報，1993.8 （4）：299306

LIU F S，HOU K W. LI S J，et al The health-protecting value ofPhvllantbus emblicaL and its prospects for exploitation andutilization [J] Journal of Naturol Resources. 1993.8 （4）：299306. （in Chinese）

[22]鐘風林，王江波，潘東明，等余甘子ISSR反應體系的優化[J]生物技術通報，2008 （3）：166-169

ZHONG F L WANG J B，PAN D M. et al_Optimization of ISSRreaction system in Pbyllanthus emblica L[J] Biotechnology Bulletin.2008 （3）： 166-169 （in Chinese）

（責任編輯：黃愛萍）

收稿日期：2021-03-16初稿：2021-05-12修改稿

作者簡介：王建超（1988-），男，研究實習員，研究方向：熱帶與業熱帶果樹種質資源保護與生理生化研究（Email： 447327289@qq.com）

通信作者：郭林榕（ 1963-），女，副研究員，研究方向：熱帶與業熱帶果樹種質資源保存、選育種及栽培研究（Email： linrong-g@163com）

基金項目：福建省科技計劃公益類專項（ 2019Rl028—ll）：國家熱帶植物種質資源庫（余甘子種質資源分庫）（NTPGRC2021-011）：農業農村部物種品種（熱帶作物）資源保護項日（ 151821301354052701）