mRNA甲基化與疾病的研究進展

李 冉，郝延磊

(1.山東大學 齊魯醫學院，山東 濟南 250100； 2.濟寧醫學院附屬醫院 神經內科， 山東 濟寧 272000)

信使RNA (messenger RNA, mRNA)是由DNA轉錄合成的一類具有遺傳信息的RNA，在蛋白質合成中起模板作用，并決定肽鏈的氨基酸序列，是人體中一類重要的RNA。甲基化是指將一個甲基基團從活性甲基化合物(如S-腺苷甲硫氨酸, S-adenosylmethionine, SAM)催化轉移到另一種化合物的過程，這個過程通過化學修飾某些蛋白質或核酸，從而形成甲基化產物。在20世紀70年代初，科學家發現甲基化修飾(N6-甲基腺苷, N6-methyladenosine, m6A)存在于mRNA上，從而證明了甲基化的存在[1]。mRNA甲基化類型很多，目前最熱門的有3種，分別是：m6A甲基化﹑N5-甲基胞苷(N5-methylcytidine, m5C)甲基化和N1-甲基腺苷(N1-methyladenosine, m1A)甲基化。mRNA甲基化參與調控多種生物學過程，其水平的異常也會導致許多臨床疾病發生。本文分別從mRNA甲基化的發現與分布情況、甲基化修飾相關酶與結合蛋白“編碼器”“消碼器”“讀碼器”三個參與者、與臨床疾病的聯系以及甲基化檢測技術進行簡要綜述。

1 甲基化的發現與分布情況

1974年發現肝癌細胞中mRNA的甲基化狀態，其中約80%為m6A。mRNA甲基化還包括m5C、m1A、N7-甲基鳥苷(N7-methylguanosine, m7G)、2’O-甲基化(2’O-methylation, Nm)、N6,2’O-二甲基腺苷(N6,2’O-dimethyladenosine, m6Am)、5-羥甲基胞苷(5-hydroxymethylcytosine, hm5C)等[1]。

借助高通量測序技術，初步獲得一個甲基化分布圖譜(圖1)。其中，m6A是mRNA中最常見和最豐富的甲基化，可影響多種生物學過程，平均每個轉錄本有1～3個m6A。m6A mRNA甲基化主要位于RRACH序列中腺嘌呤的氮原子上，約94.8%分布于基因內部，其中蛋白編碼區(sequence coding for aminoacids in protein, CDS)、非編碼區(untranslated region, UTR)和內含子的比例分別為50.9%、41.9%和2.0%。UTR區的m6A傾向于富集在3′UTR中，而CDS區的m6A主要富集在終止密碼子附近[2]。

正常情況下，m5C甲基化在真核生物轉運RNA (tRNA)和核糖體RNA (rRNA)中高豐度穩定存在，而在mRNA中含量較少；在哺乳動物的mRNA分布上十分保守，主要富集在CG區，不同組織中修飾的基因具有特異性，可調節細胞周期、促進蛋白質翻譯和分化等[3]。m1A甲基化在tRNA和rRNA中豐度也很高，近期發現也廣泛存在于真核生物各種細胞系的mRNA中；大多數m1A富集在mRNA的5′UTR區，尤其是轉錄本第一和第二位上的m1A可促進mRNA翻譯，明顯增強基因向蛋白質的表達過程，與蛋白質的產生呈正相關，而位于編碼區的m1A則抑制翻譯[4]。Nm甲基化在mRNA、tRNA、rRNA等上均有分布，普遍存在于哺乳動物、酵母、植物、病毒中，在人的mRNA中發現了數千個Nm位點；通過提高核苷酸的疏水性，從而增強其穩定性，影響mRNA與蛋白的結合、調控翻譯效率等生物過程[5]。此外，m7G甲基化也存在于各類分子中，包括mRNA 5′帽子結構與內部、tRNA和rRNA等，調節mRNA的輸出、翻譯和剪切等生物學過程[6]。

延伸帽結構經甲基化修飾后，除了富集m7G外還具有不尋常的5′-三磷酸鍵。若第一個核苷酸是腺苷(adenosine, A)且攜帶了Nm，進而可修飾成雙甲基化核苷酸：m6Am，僅存在于延伸帽中。此外，還在mRNA中發現了N4-乙酰胞苷(N4-acetylcytosine, ac4C)，富集于CDS起始處；它是由N-乙酰轉移酶10(N-acetyltransferase 10, NAT10)催化的一種保守mRNA甲基化修飾，可通過改善mRNA的穩定性和翻譯來促進靶基因的表達[7]。不同甲基化的化學結構式見圖2。

顏色表示不同甲基化，圓圈大小表示富集程度圖1 不同甲基化在mRNA中分布情況Fig 1 Distribution of different methylation modifications in mRNA

圖2 不同甲基化的化學結構式Fig 2 Chemical structural formula of different methylation modifications

2 甲基化修飾相關酶與蛋白

甲基化修飾是一種動態可逆的過程(圖3)，對mRNA的影響通常需要以下三者的參與：“編碼器”(writers)是指甲基轉移酶，甲基化是由一個多亞單位以高度特異性的方式添加到mRNA上的；而“消碼器”(erasers)則是指可以逆轉甲基化過程的去甲基化酶；甲基化修飾后的mRNA具有特定的生物學功能，需要特定的RNA結合蛋白，即“讀碼器”(readers)[2]。

圖3 甲基化動態可逆過程Fig 3 Dynamic reversible process of methylation

m5C甲基化可調控mRNA出核，NSUN2蛋白是m5C mRNA主要的甲基轉移酶，NSUN2缺失可導致mRNA的出核受到抑制；RNA結合蛋白ALYREF特異性結合m5C修飾位點，從而促進mRNA出核；而敲除m5C mRNA另一個甲基轉移酶TRM4B，可導致mRNA上m5C水平減少并降低穩定性[3]。甲基轉移酶TRMT6/61A參與m1A甲基化，m1A mRNA優先被募集到多核糖體以促進翻譯伸長；ALKBH1、ALKBH3作為m1A mRNA去甲基化酶，能夠催化m1A mRNA去甲基化，從而調控翻譯[4]。METTL1則是m7G mRNA的甲基化轉移酶[6]。由于m6A甲基化占全部mRNA甲基化的80%以上，以下對m6A甲基化的“編碼器”“消碼器”和“讀碼器”進行詳細介紹。

2.1 m6A“編碼器”

是指m6A甲基轉移酶，一組重要的催化酶。甲基轉移酶3/14 (methyltransferase like 3/14, METTL3/14)、Wilms腫瘤結合蛋白1 (Wilms′ tumor 1-associating protein, WTAP)、VIRMA (Vir like m6A methyltransferase associated)、Cbl原癌基因1 (Cbl proto-oncogene like 1, CBLL1)、鋅指CCCH域蛋白13 (zinc finger CCCH-type containing 13, ZC3H13)和RNA結合基序蛋白15/15B (RNA binding motif protein 15/15B, RBM15/15B)等形成m6A“編碼器”復合物共同發揮催化作用[2]。

METTL3和METTL14以1∶1的化學計量比形成一個穩定的復合物，復合物的甲基化活性高于單獨的METTL3。METTL3具有催化能力，最早被發現可以結合SAM，在真核生物中高度保守。而METTL14雖與METTL3同源，但在催化上并不活躍，不與SAM結合，不具有獨立的m6A甲基轉移酶功能，是復合物中的一個惰性物質；但包含RNA結合位點，可穩定METTL3，還是METTL3酶活性的變構激活劑。但近期發現一些m6A位點是由METTL14形成的，純化的METTL14具有獨立于METTL3的m6A合成能力[8]。

WTAP是m6A“編碼器”的調節亞基，可與METTL3-METTL14復合物相互作用，將“編碼器”錨定在染色質上，對m6A的形成至關重要；敲除后可導致METTL3-METTL14的核散斑體定位丟失，能顯著降低細胞mRNA中m6A峰值，甚至比直接敲除METTL3或METTL14更明顯[8]。VIRMA最初稱為KIAA1429，與WTAP、METTL14一樣是甲基化所必需的，其N端具有募集甲基轉移酶中METTL3、METTL14、WTAP的能力，繼而能實現對mRNA上m6A水平的定點調控；敲除后可導致哺乳動物細胞中m6A的大量丟失[9]。

RBM15/15B這2種同源RNA結合蛋白都含有RNA結合結構域，可促進編碼器在mRNA中特定位點的聚集。單獨敲除RBM15或RBM15B可降低細胞mRNA中的m6A水平，同時敲除二者可使m6A水平顯著降低[10]。CBLL1又稱HAKAI，是一種E3泛素連接酶，參與m6A mRNA甲基化，敲除后可導致m6A水平的降低。ZC3H13是將WTAP-VIRMA-HAKAI復合物固定在細胞核中的關鍵，敲除后可導致m6A水平的降低[11]。

2.2 m6A“消碼器”

是將m6A轉化為A的去甲基化酶。在人子宮頸癌(HeLa)細胞系的生命周期中，mRNA中的m6A水平是穩定的；m6A“消碼器”似乎僅限于特定組織，如睪丸，或在特定的應激和疾病相關條件下[12]。在真核生物中，它包括脂肪與肥胖相關基因蛋白(fat mass and obesity associated, FTO)和Alk B同源蛋白5(Alk B homologue 5, ALKBH5)。

FTO是Alk B家族的一員，也被稱為Alk B同源蛋白9 (ALKBH9)，與肥胖相關，是最早被發現的m6A mRNA去甲基化酶，可影響剪切因子SRSF2的RNA結合能力，進而調控mRNA前體的剪切加工過程；但最新發現，FTO優先去甲基化m6Am而非m6A，降低了m6Am mRNA的穩定性[13]。而ALKBH5是Alk B家族的另一種去甲基化酶，在N端有一個富含丙氨酸的區域和一個獨特的螺旋折疊結構；它不同于FTO的氧化去甲基化，可直接催化m6A mRNA去甲基化；ALKBH5的去甲基化活性顯著影響mRNA的輸出和剪切等生物學過程，缺乏或過表達分別導致細胞m6A水平的增加或減少，其基因敲除可使雄性小鼠減數分裂中期精母細胞凋亡導致生育能力受損[14]。

2.3 m6A“讀碼器”

包括含有YTH (YT521-B homology)結構域的RNA結合蛋白(YTH domain containing/YTH domain family, YTPDC/YTPDF)、核內不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins, hnRNP)、真核起始因子3(eukaryotic initiation factor 3, eIF3)、脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein, FMRP)、胰島素樣生長因子ⅡmRNA結合蛋白(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding proteins, IGF2BP)和富含脯氨酸卷曲螺旋蛋白2A (proline-rich coiled-coil 2A, PRRC2A)等。其主要功能包括與m6A甲基化區域的特異性結合、削弱與RNA閱讀蛋白的同源性結合、改變RNA的二級結構以改變蛋白質與RNA的相互作用等[2]。

在哺乳動物中有5種含有YTH結構域的蛋白質：YTHDC1/2(DC1/2)和YTHDF1～3(DF1～3)，它們在C末端都有一個YTH結構域，能與m6A mRNA上的RRACH片段特異性結合，而其富含脯氨酸/谷氨酰胺/天冬酰胺(P/Q/N)的結構域與亞細胞定位有關。DC1識別位點主要在細胞核內，介導甲基化mRNA從核內向胞質中的輸出，其基因敲除可導致核內m6A mRNA停留時間延長，轉錄產物在核內積累，并伴隨胞質中的消耗；DC1可與剪接因子和核輸出適配器蛋白SRSF3相互作用來調節mRNA的剪接。DC2識別位點主要在細胞質中，加速修飾后的mRNA降解，并促進相關蛋白的翻譯；與其他廣泛表達的YTH蛋白不同，DC2在生殖細胞中富集，DC2敲除的小鼠，生殖細胞發育缺陷，生殖器官小于正常小鼠。DF識別位點也在細胞質中，參與m6A mRNA降解階段的液-液相分離；其中，DF2是第一個被發現的m6A結合蛋白，識別結合m6A mRNA，調節mRNA的穩定性，促進其降解；DF1與翻譯起始因子和核糖體結合，而DF3與DF1協同作用，促進m6A mRNA的翻譯[15]。

hnRNP是一組含有近30個分子質量的RNA結合蛋白，它們可以相互作用形成復合物，A1/2、B1/2、C1/2是主要組成部分；hnRNPA2/B1能夠特異性識別m6A對mRNA的修飾[16]。hnRNPC負責識別m6A修飾基，并在核內介導mRNA前體的加工、剪接，影響靶基因的豐度和選擇性剪接。m6A可增加RNA序列位點與核內不均一核糖核蛋白G (hnRNPG)結合的可及性；在轉錄本中，m6A調控RNA-hnRNPG相互作用，以影響靶mRNA表達和選擇性剪接[17]。

此外，核糖體可作為m6A“讀碼器”，細菌的核糖體停留在m6A mRNA的密碼子位點上，盡管哺乳動物的核糖體不同于細菌的核糖體，但有數據顯示哺乳動物的核糖體也有在m6A位點處停滯的趨勢[18]。IGF2BP和FMRP也可作為m6A“讀碼器”，它們似乎能增強m6A mRNA的翻譯和穩定性。IGF2BP作為一個獨特的m6A“讀碼器”，通過識別共有的GGC序列來靶向調控mRNA轉錄；與含有YTH結構域的蛋白相比，IGF2BP對m6A mRNA的親和力較弱，對m6A mRNA和非甲基化mRNA的區分能力較差[19]。FMRP是一種選擇性RNA結合蛋白，可與mRNA的m6A位點結合，并和DF2相互作用，通過DF2調控m6A mRNA靶點的穩定性[20]。在哺乳動物細胞中，eIF3是最大的真核起始因子，在真核翻譯的起始過程中起關鍵作用，能直接與mRNA 5′UTR的m6A結合，從而促進mRNA的翻譯[2]。PRRC2A也是新發現的m6A“讀碼器”，通過m6A與CDS區中的GGACU序列結合來穩定mRNA的表達，在少突膠質細胞的發育中起重要作用[21]。

3 甲基化與疾病

甲基化修飾正常存在，參與多種生物學過程的調控，而甲基化水平的異常則會引起生物功能的紊亂，進而引起相關的臨床疾病。其中，m6A是甲基化中最為廣泛和豐富的修飾，下面著重以m6A甲基化為例，從腫瘤疾病、代謝疾病、病毒感染、心臟和神經疾病等5個方面介紹與疾病的聯系。

3.1 m6A與腫瘤疾病

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是原發性肝癌的主要類型，發病率和病死率分別居全球第五位、第三位，其進展與m6A異常改變有關；METTL3上調或METTL14下調預示HCC患者預后不良，前者通過DF2促進HCC細胞增殖、遷移和集落形成，有助于HCC的進展；而METTL14則是一種抗轉移因子，可抑制HCC細胞的轉移，在HCC中顯著下調，尤其是轉移性HCC細胞，可導致m6A水平降低，進而增強HCC細胞的轉移能力；DF1過表達也與HCC的進展有關，可能是HCC預后不良的新預測因子，它與HCC的病理分期呈正相關，隨著HCC的分期升高而顯著上調，還與5年生存率和無病生存率相關；WTAP在HCC中的表達也增加，促進HCC細胞在體內的增殖和成瘤能力，調節HCC細胞的細胞周期，進而促進HCC的進展。在中位生存期為5～8個月最具侵襲性的胰腺癌中，ALKBH5下調、DF2上調，促進腫瘤增殖；DF2可能是預測胰腺癌一種新的生物標志物，FTO則可促進胰腺導管腺癌的發生發展[22-23]。此外，胃癌(gastric carcinoma, GC)患者ALKBH5和FTO的表達明顯下調，其m6A水平明顯高于良性胃病患者和健康人，且隨著GC的進展和轉移而升高，GC患者術后m6A水平降低。而在結直腸癌中，DF1與其深度、淋巴結轉移等有關，當DF1敲除時，對結直腸癌細胞的增殖有明顯的抑制作用，DF1敲除的DC細胞則可產生抗腫瘤應答；DC2也能夠促進結腸腫瘤轉移[24-25]。

急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia, AML)是最常見的血液系統惡性腫瘤之一，治療難度較大，具有明顯的遺傳性。METTL3在AML干細胞和原發性AML患者樣本中的含量明顯高于人造血干細胞和其他腫瘤細胞，它介導的m6A升高在維持AML多能性和抑制骨髓細胞正常分化中起重要作用，激活癌基因導致AML的發生；若在AML干細胞中敲除METTL3則能誘導細胞分化和凋亡，延緩AML的進展。同樣，METTL14也通過m6A修飾調節靶基因發揮致癌作用，它在AML細胞中高表達，是AML干細胞自我更新和維持所必需的，而敲除METTL4也能夠抑制AML細胞的更新和增值。FTO也在AML中高表達，通過下調mRNA m6A甲基化水平而調控靶標蛋白的表達量，增強AML原癌基因介導的細胞轉化和AML的形成。DF2也參與維持AML和AML干細胞自我更新。而RBM15則與兒童急性巨核細胞白血病(acute megakaryocytic leukemia, AMKL)有關，其表達可誘導和加速AMKL的發生[23]。

宮頸鱗狀細胞癌(cervical squamous cell carcinoma, CSCC)是常見的婦科惡性腫瘤之一，約占90%以上；與相鄰正常組織相比，CSCC組織中FTO表達顯著升高，FTO通過降低m6A水平，可增強化療抵抗力，而抑制FTO可增加CSCC的化療敏感性；METTL3則可促進CSCC細胞的存活、增殖和侵襲。此外，與正常子宮內膜相比，約70%的子宮內膜癌顯示m6A水平降低，可增強子宮內膜癌細胞的增殖和致瘤性，這是由于METTL14或METTL3表達減少所致。而乳腺癌在女性所有惡性腫瘤中發病率和病死率最高，低氧可誘導乳腺癌干細胞(breast cancer stem cells, BCSC) ALKBH5的表達；ALKBH5降低mRNA中m6A水平，增強mRNA的穩定性，導致BCSC蛋白質水平增加，促進BCSC在低氧微環境中的富集和乳腺癌的發生，而缺乏ALKBH5則不利于BCSC富集和腫瘤發生；METTL3在乳腺癌的發生發展中呈強烈正相關，通過抑制腫瘤抑制因子進而加速乳腺癌的發展[23]。

肺腺癌患者的METTL3表達升高，可促進肺癌細胞的存活、增殖和侵襲，在肺癌中起到癌基因的作用；eIF3可與METTL3結合，也促進癌基因的翻譯和癌變。前列腺癌患者的DF2顯著上調，若敲除則可顯著降低m6A水平，進而抑制前列腺癌細胞的增殖和遷移[23]。

3.2 m6A與代謝疾病

m6A甲基化可促進脂肪細胞葡萄糖氧化，適當水平的m6A可維持血糖穩定。胰島素是人體內唯一能降低血糖的激素，由胰島β細胞分泌，胰島細胞尤其是β細胞的生物學調控在葡萄糖穩態中起著關鍵作用。m6A可通過調節基因表達來調節β細胞周期和胰島素分泌，胰島中的m6A mRNA減少可能影響胰島素分泌的代謝途徑，從而導致II型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)。FTO介導的m6A水平下降與血糖有關，T2DM患者的胰島中FTO表達增加且m6A水平顯著降低，而高血糖則使FTO含量升高。而在T2DM患者的肝中，m6A水平和METTL3持續上調；METTL3可通過m6A甲基化抑制肝胰島素敏感性，促進脂肪酸代謝；METTL3敲除可降低m6A水平，進而抑制脂肪酸代謝，脂肪酸合成減少，胰島素敏感性提高[22]。

FTO普遍存在于脂肪和肌肉組織中，與人類體重增加和肥胖密切相關，FTO過表達的個體通常具有較高的體質指數(body mass index, BMI)；它通過去甲基化作用調節剪接位點周圍m6A水平，調節脂肪生成調節因子的外源性剪接來控制脂肪細胞的分化，且調節能量穩態和多巴胺能途徑，從而增強表達促進脂肪前體細胞的有絲分裂和脂肪的形成；m6A通過DF1增強翻譯，提高蛋白水平，亦可促進脂肪生成；此外，WTAP、METTL3、METTL14也參與脂肪生成的調節，若敲除則可導致細胞周期停滯和脂肪生成受損。而肝三酰甘油積聚是非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)最重要的特征，m6A mRNA在脂肪酸代謝、三酰甘油代謝等與脂質代謝相關的過程和途徑中顯著富集；肝臟中FTO過表達使得m6A水平降低，可致人類肝細胞中更多的脂質積聚，進而導致血脂異常和NAFLD；而METTL3過表達使得m6A含量升高，可抑制促脂肪基因的表達，從而抑制脂肪的生成并降低細胞三酰甘油含量[22]。

3.3 m6A與病毒感染

甲基化修飾與許多病毒感染密切相關，病毒感染后細胞核內ALKBH5水平顯著增加，使得抗病毒效應分子mRNA發生去甲基化修飾，抑制了抗病毒效應分子蛋白的表達，從而降低干擾素產生，最終抑制抗病毒天然免疫應答反應；在感染后期，m6A可促進病毒蛋白在受感染細胞中的翻譯。HIV-1病毒感染CD4淋巴細胞后(該細胞為艾滋病病毒的主要攻擊對象)，不管是病毒自身mRNA，還是宿主細胞mRNA，都能促進其甲基化修飾；若敲除METTL3和METTL14，可使HIV-1的復制受到抑制，而敲除ALKBH5則促進HIV-1的復制；DF的3種蛋白都可識別并結合HIV-1 mRNA中m6A的修飾位點，在HIV-1病毒復制過程中發揮負調控作用，增強病毒mRNA的表達。同樣，m6A甲基化不但影響寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)自身的轉錄，還影響宿主mRNA的結構和功能；m6A在ZIKV中水平升高，METTL3、METTL14、FTO、ALKBH5和DF等甲基化修飾相關酶與蛋白參與病毒復制的負調控；任意敲除DF三種中的單獨一種，都可促進ZIKV的復制，且敲除DF2對病毒復制的促進作用最強；敲除ALKBH5能顯著促進病毒復制，而敲除METTL14則抑制。當細胞感染Kaposi肉瘤病毒(kaposi’s sarcoma herpesvirus, KSHV)后，可促進m6A甲基化；當KSHV裂解宿主細胞時，m6A甲基化程度與細胞裂解程度呈成反比；敲除感染細胞中METTL3或DF，并使其分別感染正常細胞，發現病毒的復制受到抑制，并且病毒裂解反式激活因子也受到了抑制。此外，m6A mRNA甲基化也影響著丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)的感染，其中METTL3、METTL14、FTO、DF等甲基化修飾相關酶與蛋白參與調控HCV感染[25]。

3.4 m6A與心臟疾病

FTO與心肌收縮力有關，心力衰竭(heart failure, HF)的心臟和缺氧心肌細胞中的FTO顯著降低，m6A水平升高；FTO缺乏則會導致鈣處理和肌節動力學異常，進而使得心肌細胞收縮功能喪失；m6A在心肌細胞增殖中也起著重要作用，METTL3與心肌細胞肥大有關，其在心臟中的水平升高可導致代償性肥大，但不影響心功能，而敲除METTL3則可誘導偏心重塑，進而導致HF的形態學和功能體征。血脂異常和慢性炎性反應是冠心病(coronary heart disease, CHD)的重要危險因素，m6A通過調節脂質代謝和慢性炎性反應進而參與CHD的發生發展；FTO高表達可使患CHD的風險高出約20%，即使調整了BMI、血脂和血糖水平，FTO與CHD之間也存在著直接關聯。此外，FTO還與肥厚型心肌病、室間隔缺損、房室缺損和心律失常等心臟疾病的發生有關[22]。

3.5 m6A與神經系統疾病

膠質母細胞瘤(glioblastoma, GBM)是最致命的原發性腦腫瘤，膠質母細胞瘤干細胞(Glioblastoma stem cells, GSC)是一類具有促進GBM生長和侵襲能力的細胞，它的存在預示著GBM預后不良；m6A甲基化與GBM相關，敲除METTL3或METTL14，m6A水平降低，可明顯促進GSC的增殖、自我更新并增強成瘤性，而敲除FTO則可抑制GSC的增殖與自我更新；ALKBH5在GSC中高表達，通過調控下游分子FOXM1來調控GSC的自我更新與成瘤能力，使m6A水平顯著降低，可致GBM發生且預后不良[23]。同時，ALKBH5還與抑郁癥相關，ZC3H13與精神分裂癥相關，FTO則與注意缺陷/多動障礙、阿爾茨海默病、腦萎縮和抑郁癥等多種神經系統疾病相關[24]。

此外，m6A甲基化通過對mRNA代謝的影響，還可控制晝夜節律、細胞增殖和存活的關鍵激酶，直接影響晝夜節律的長度，m6A的缺失則導致晝夜節律延長[25]。mRNA甲基化修飾的異常還可導致：不育、高血壓、生長遲緩、發育停滯、面部畸形等情況[23]。

4 甲基化相關的檢測技術

近年來，對mRNA甲基化修飾的研究越來越多，相應的檢測技術繁多，如m6A基于抗體的檢測有m6A-CLIP/IP、LAIC-seq等，基于消化的檢測有SCARLET、LC-MS等，基于RT的檢測有RT-KTQ聚合酶等，基于連接的檢測有SELECT等，還有納米通道和SMRT是直接基于RNA的檢測。目前常用的方法有三種：1)液質聯用質譜檢測法，主要通過使用結合酶處理和離子打碎的方式，把核酸打碎成核苷和堿基，通過質譜譜圖和峰值計算出m6A和總A的比例，從而得知m6A的整體水平；但該法無法將m6A修飾定量到具體是哪種RNA發生了修飾以及修飾的具體位置，并且操作較為復雜、價格較為昂貴、平臺限制較強。2)光譜比色法，該法同質譜法相同的點在于：都是揭示樣本m6A修飾總體水平，但更為簡單易操作；其方法原理類似于蛋白的ELISA檢測，將目標RNA同m6A抗體孵育，然后將孵育后液體轉移至包被m6A的孔板中孵育、洗脫(只有和孔板中m6A結合的m6A抗體才能保留下來)，進行抗體信號生成反應，最后檢測抗體信號；在整個實驗過程中會使用到標準品的標準曲線進行精準定量，該法優點是目前市面上已有眾多成熟的試劑盒，可直接購買隨時使用，方法標準化、所需樣本量少、操作簡單、靈敏度高；但mRNA上m6A的定量容易受到含有m6A的rRNA和snRNA的干擾。3)高通量測序法(MeRIP-Seq)，主要是依賴于高通量測序儀對核苷酸序列實現序列組成測定的技術檢測m6A修飾，其中應用最為熱門的技術就是MeRIP-seq，其優點：1)針對全基因組范圍內檢測m6A的存在; 2)m6A的檢測結果可以精確到基因，明確發生甲基化修飾的序列來源于哪個基因以及位置信息; 3)能夠明確每個基因的修飾水平，進行組與組之間比較; 4)檢測平臺為測序儀，儀器限制低、通用性高、重復性好; 5)結果可以和其他組學聯合分析，從多維度闡述機制; 6)實驗操作簡單、入門容易、所需樣本量少。其缺點：1)無法區分m6A和m6Am; 2)RNA測序需要識別m6A位點，無法識別峰值內的多個m6A位點和具有單核苷酸分辨率的m6A位點; 3)假陽性風險高[2]。

5 問題與展望

mRNA甲基化修飾是目前比較新興的領域，自2011年第一個m6A去甲基化酶發現以來，以m6A為代表的RNA表觀轉錄學領域發展迅速。其中，m6A甲基化﹑m5C甲基化﹑m1A甲基化是mRNA甲基化修飾研究最多的三個方面，各種研究豐富了對mRNA甲基化修飾的認識。積極探究未知的mRNA甲基化修飾相關酶與蛋白、相關測序技術的創新與整合、如何更為簡便快捷的檢測mRNA甲基化修飾等都是大家比較關注的問題。同時，也越來越重視mRNA甲基化修飾與臨床疾病的關聯，尋找潛在的治療靶點以利于更好地靶向治療，不斷研究開發相關酶與蛋白的抑制劑或激動劑以用于臨床治療，也是未來研究的重大問題。