基于磁珠捕獲和連接的免核酸提取的恒溫擴增技術(shù)

邱櫟臻，楊明珠，駢紅茹，鄭 直

(中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎(chǔ)學院 生物化學與分子生物學系，北京 100005)

核酸檢測在疾病篩查、用藥指導、預后判斷和監(jiān)測等方面扮演重要角色，在新型冠狀病毒病(corona virus disease,COVID-19)的防控、篩查、治療過程中體現(xiàn)得淋漓盡致[1-2]。其中聚合酶鏈式反應(PCR)和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)一直是實驗室進行分子診斷和病原學檢測的金標準[3]，PCR方法以其高靈敏度和高特異性這一特點被廣泛使用，然而這種方法需要高昂的成本，需要基于實驗室的設(shè)備和專業(yè)知識，應用到現(xiàn)場檢測需要克服許多不利因素，因此研究人員逐漸將目光轉(zhuǎn)向利用單一溫度進行擴增的技術(shù)[4-5]。

環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是21世紀發(fā)展起來的一種新穎的等溫核酸擴增技術(shù)，與普通PCR比起來不需要溫度控制精確的模塊體系，恒溫完成擴增，具有高靈敏度，高特異性和快速擴增的優(yōu)點[6-8]。現(xiàn)在發(fā)展成不依賴昂貴的PCR儀就能實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測的一種方法，檢測成本遠低于熒光定量PCR,可作為快速簡便的診斷方法來檢測和識別病原微生物感染[9]。本研究擬建立一種基于磁珠捕獲的免提核酸環(huán)介導恒溫擴增技術(shù)CLIP-LAMP (capture and ligation probe-LAMP)，能夠快速、簡便地進行大體積病原體檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

主要試劑：1 μmol/L鏈霉親和素磁珠(Invitrogen公司)； T4 多聚核苷酸激酶、BstDNA 聚合酶大片段和1× ThermoPol 反應緩沖液(New England Biolabs， NEB 公司)；裂解液、洗液(Diacutate 公司)；T4 DNA 連接酶(北京康為世紀生物科技有限公司);甜菜堿(Sigma-Aldrich公司)； dNTPS [寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司]； SYBR Green Ⅰ(廈門致善生物科技股份有限公司)； BSA(Cell Signaling Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫缺陷病(human immunodeficiency virus，HIV)檢測模板體外轉(zhuǎn)錄(invitrotranscription,IVT)制備：查閱文獻資料，登錄pubmed下載主要在中國流行的 HIV-1型的 CRF07-BC、 CRF08-BC和 CRF01-AE 亞型，找到gag和pol基因，選取3種亞型共有的保守序列導入 pcDNA3.1(+) 質(zhì)粒載體中，搖菌擴大培養(yǎng)，提質(zhì)粒酶切為線性，然后反轉(zhuǎn)錄為 RNA 進一步純化，最后測濃度定量， IVT從 1.0×105CPs(copies)/μL梯度稀釋到1.28 CPs /μL，呈5倍稀釋作為 HIV 檢測模板進行后續(xù)試驗。

1.2.2 磁珠偶聯(lián)寡核苷酸制備：文獻中提到磁珠通過修飾鏈霉親和素可與被生物素標記的寡核苷酸連接，從而起到捕獲靶標的效果[10-11]，且磁珠自身有富集大體積樣品的優(yōu)勢。選取粒徑大小1 μm 的鏈霉親和素磁珠，與被biotin修飾的寡核苷酸探針結(jié)合。取1 mg(1 μmol/L)磁珠到1.5 mL 離心管中，去上清并用2×結(jié)合緩沖洗1遍，加200 μL緩沖液重懸，加入20 μL 100 μmol/L 探針和180 μL 水室溫振蕩30 min，隨后1×結(jié)合緩沖洗3遍，用1 mL 水重懸即可使用。

1.2.3 捕獲探針設(shè)計和檢測：以上面保守序列為模板，根據(jù)特定設(shè)置條件挑選捕獲和檢測探針，檢測探針設(shè)計成帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列，所有探針和引物均從生工公司訂購。

1.2.4 基于磁珠 CLIP-LAMP 實驗方法：此實驗中分為捕獲靶標、連接探針、熒光檢測定量3步進行。在1.5 mL 離心管中加入捕獲體系300 μL，1 μmol/L偶聯(lián)寡核苷酸磁珠30 μL，探針終濃度100 nmol/L，在特定的鹽離子濃度下，磁珠連接捕獲探針特異性捕獲靶標；置于金屬振蕩儀器中55 ℃，12 000 r/min，1 h 進行捕獲反應。捕獲結(jié)束將離心管放置到磁力架上，通過磁場吸附磁珠去除廢液，加入1×washing buffer后用渦旋儀振蕩混勻；再放到磁力架去除洗液，重復兩次，加入連接體系50 μL (含有2 μL 的5×106U/L的 T4 DNA 連接酶，10 μL 的5×ligation buffer)，渦旋儀混勻放入金屬振蕩儀器中37 ℃，300 r/min，10 min即可完成連接反應。將離心管拿出置于磁力架上，去除連接體系，加入25 μL最終恒溫擴增LAMP體系(含有甜菜堿，前端引物FIP，后端引物BIP，dNTP，BstDNA 聚合酶大片段， SYBR Green Ⅰ，由20 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L KCl、10 mmol/L(NH4)2SO4、 2 mmol/L MgSO4和0.1% Triton X-100, pH 8.8組成的1×ThermoPol buffer),混勻后轉(zhuǎn)入96孔板中置于熒光定量PCR儀中進行LAMP擴增，恒溫65 ℃擴增45 min，每分鐘采集1次熒光信號記錄熒光信號變化。整個過程如圖1所示。

SA.streptavidin; FIP,BIP.LAMP primer; MNPs.magnetic beads; A.hybridization between streptavidin-coated magnetic beads and biotin-labeled DNA molecules; B.CLIP-LAMP schematic diagram

2 結(jié)果

2.1 實驗優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 BSA (bovine serum albumin) 對LAMP 反應階段的影響： BSA 加入最后 LAMP 反應可以對磁珠狀態(tài)的穩(wěn)定起到一定作用，比較 10、7、4 和1 mg/mL的 BSA 溶液，通過實驗得出1 mg/mL的 BSA 使得反應速度加快，效果最好(表1，圖2)。

表1 不同濃度BSA 的檢測結(jié)果

CPs.copies; Cq.quantification cycle;*P<0.05 compared with NTC group; NTC.no template control圖2 CLIP-LAMP反應中BSA的優(yōu)化Fig 2 Optimization of BSA in CLIP-LAMP reaction

2.1.2 磁珠捕獲體積遞增實驗：選取2×104和4×103CPs/μL兩種IVT 樣品進行實驗，捕獲體積分別為100 μL、200 μL、500 μL和1 mL，捕獲體積越大，此方法的靈敏度越低(表2，圖3)。

表2 不同捕獲體積檢測結(jié)果

CPs.copies; Cq.quantification cycle圖3 磁珠捕獲體積遞增試驗Fig 3 Capture volume of magnetic beads increasing

2.2 基于磁珠CLIP-LAMP檢測HIV的IVT靈敏度分析

將HIV的IVT從1×105CPs/μL至32 CPs/μL依次進行5倍梯度稀釋，以IVT濃度的對數(shù)值為橫坐標，測得的Cq值(擴增達到熒光閾值時所經(jīng)歷的時間)為縱坐標，繪制標準曲線圖，線性關(guān)系良好，R2=0.94，可以穩(wěn)定測到32 CPs/μL的IVT(圖4)。

2.3 基于磁珠CLIP-LAMP檢測HIV的IVT特異性分析

基于磁珠CLIP-LAMP 檢測 HIV 的 IVT 的特異性評估如5圖所示， positive control選擇的是4×103CPs/μL的 IVT 樣本， negtive control 選擇的是健康的人血樣本，NTC(no template control)是未加模板的對照。圖中可以看出，此方法只在 IVT 樣品中準確檢測出信號，在健康人血中和NTC中未檢測出信號，特異性良好。

2.4 基于磁珠CLIP-LAMP檢測HIV的IVT的重復性分析

IVT濃度從1×105CPs/μL到32 CPs/μL的變化中，Cq值的變異系數(shù)(coefficient of variation，CV)均小于5%，表明數(shù)據(jù)真實有效(表3)。

表3 磁珠CLIP-LAMP的重復性

3 討論

本研究基于磁珠捕獲免核酸提取環(huán)介導恒溫擴增的方法成功建立，通過免提核酸使用磁珠富集靶標核苷酸可以輕松處理大體積樣本，免提核酸避免了繁瑣的核酸提取步驟以及提取過程中的損失，普通96孔板可裂解處理樣品50 μL，而磁珠可以在1.5 mL的離心管中裂解富集1 mL的樣品，因而大體積富集有能力達到較低的靈敏度，本研究的靈敏度還可以通過改變磁珠偶聯(lián)核酸方式得到提升，后續(xù)優(yōu)化有潛力達到更低的靈敏度。LAMP檢測對設(shè)備沒有特殊要求，不需要昂貴的PCR儀器，僅需要簡單的恒溫擴增儀器恒溫保持30～60 min即可,這一優(yōu)勢決定其對各種應用場景接納度高，受限小。

本研究方法與普通LAMP方法比較具有更強的特異性，常規(guī)LAMP引物只能針對一個位點進行設(shè)計擴增，本方法的CLIP-LAMP可以針對一段較長的靶標檢測區(qū)域設(shè)計多對檢測探針同時進行擴增反應，檢測探針覆蓋域更長，所以檢測較常規(guī)LAMP更加靈敏。其次一對檢測探針中間的連接步驟也進一步增強了檢測的特異性，彌補了常規(guī)LAMP容易出現(xiàn)的假陽性問題。檢測探針的莖環(huán)結(jié)構(gòu)尾巴是通用的，可以僅替換檢測靶標序列達到檢測不同病原體的效果。

CPs.copies; Cq.quantification cycle圖4 磁珠CLIP-LAMP檢測HIV的IVT的實時熒光曲線和線性關(guān)系Fig 4 HIV detection sensitivity and dynamic range of CLIP-LAMP on magnetic beads n=3)

圖5 磁珠CLIP-LAMP檢測HIV體外轉(zhuǎn)錄(IVT)的特異性Fig 5 HIV detection specificity of CLIP-LAMP for in vitro transcription(IVT) magnetic beads

國內(nèi)艾滋病形勢較為嚴峻，目前有效消除艾滋病最重要的環(huán)節(jié)就是控制艾滋病的傳播，大規(guī)模進行重點人群艾滋病的檢測并且盡早地發(fā)現(xiàn)感染者是重中之重，本研究建立的基于磁珠CLIP-LAMP方法可以穩(wěn)定檢測到32 CPs/μL的HIV IVT濃度，并在將來通過進一步優(yōu)化達到更低的濃度。綜上所述，本研究成功建立起基于磁珠免核酸提取恒溫擴增技術(shù)，為HIV檢測帶來新的思路和方法。