黃芪甲苷IV減輕尿毒癥模型大鼠腎血管內皮損傷

朱文勝，鄭忠毓，李曉霞，鄧建南，張吉春

(重慶市萬州區(qū)第五人民醫(yī)院 腎內科， 重慶 404100)

尿毒癥(uremia)是各種晚期的腎臟病共有的臨床綜合征。在中國，尿毒癥發(fā)病率和病死率隨著老齡化人口的增加而不斷上升[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)，血管內皮功能障礙，是尿毒癥的首要死亡原因，也是臨床研究的重點和難點問題[2]。核因子E2相關因子2(nuclear factor-E2-related factor2,Nrf2)/血紅素氧合酶-1(hemeoxygenase1，HO-1)在細胞抗氧化損傷和抗炎性損傷過程中發(fā)揮主要作用，并參與血管內皮損傷過程[3]。黃芪甲苷Ⅳ(astragaloside Ⅳ)是中藥黃芪的主要活性成分，具有抗炎、降血脂、改善糖尿病引起的血管病變和心肌病等作用[4]，但其作用機制尚不清楚，本文通過腎臟切除法建立大鼠尿毒癥模型，對此進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：SPF級SD雄性大鼠，體質量：220～240 g[廣東省醫(yī)學實驗動物中心，生產許可證號為SCXK(粵) 2016-0002]，動物質量合格證號為省科委2000A027。

1.1.2 主要試劑 黃芪甲苷Ⅳ(上海阿拉丁生化科技有限公司)；Nrf2抑制劑(MedchemExpress公司)；白細胞介素-6(IL-6)酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)；肌酐(Scr)ELISA試劑盒(上海一研生物科技有限公司)； 尿素氮(blood urea nitrogen，BUN) ELISA試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司)；血β2-微球蛋白(β2-microglobulin，β2-MG)ELISA試劑盒(上海研生實業(yè)有限公司)；兔抗大鼠一抗Nrf2、HO-1(Proteinech Group公司)；小鼠抗CD31、兔抗內皮型一氧化氮(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、血管生成素樣蛋白6(angiopoietin like protein 6，ANGPTL6)、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)等抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：取70只大鼠，按文獻[5]方法切除占腎臟1/3的上極和下極左腎腎臟，術后1周進行完全摘除右腎手術，制備尿毒癥模型，4周后大鼠成活，隨機取2只大鼠剩余腎臟進行鏡檢，若出現(xiàn)腎血管內皮出現(xiàn)水腫、增大現(xiàn)象，視為造模成功，共造模成功60只(有3只于術后1周死亡，2只術后3周死亡，3只手術失敗死亡)，將造模成功的大鼠隨機分為模型組、黃芪甲苷低(100 mg/kg)、高(200 mg/kg)劑量組、Nrf2抑制劑組(2 mg/kg)、黃芪甲苷+Nrf2抑制劑組(200 mg/kg+2 mg/kg)，每組12只。另取12只大鼠，僅行麻醉和暴露雙腎，不做手術切除，作為假手術組。黃芪甲苷及Nrf2抑制劑參照文獻[6-7]設置劑量，用0.9%氯化鈉溶液稀釋成為10.0、20.0、0.2 mg/mL的混懸液，按10 mL/kg的劑量腹腔注射給藥，黃芪甲苷給藥3次/d，Nrf2抑制劑給藥1次/d；黃芪甲苷+Nrf2抑制劑組給予黃芪甲苷的同時腹腔注射給予Nrf2抑制劑；假手術組及模型組給予等量0.9%氯化鈉溶液，各組均連續(xù)給藥4周，給藥期間觀察大鼠行為及死亡狀況。

1.2.2 采集標本及透射電鏡觀察腎血管病變：末次給藥12 h后，麻醉大鼠，取腹主動脈血3 mL，3 000 r/min離心10 min后，取上清液于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｌ幩来笫螅馄嗜∈Ｓ嗄I臟組織，經磷酸緩沖鹽沖洗后，切取腎組織0.5 g置于-80 ℃冰箱保存，剩余腎組織分成2部分，一部分送于電鏡室進行鏡檢并觀察拍照；另一部分制成冰凍切片備用。

1.2.3 ELISA檢測大鼠血清Scr、BUN、β2-MG、TNF-α、IL-6水平：以ELISA試劑盒說明書方法檢測Scr、BUN、β2-MG及血清TNF-α、IL-6水平。

1.2.4 免疫熒光檢測腎組織ROS蓄積水平：取部分新鮮冰凍切片，加入二氫乙啶(dihydroethidium，DHE)探針并于室溫下孵育20 min后，置于熒光顯微鏡下觀察組織染色情況。并隨機取5個視野，用Image Pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)以單位面積內綠色熒光強度強弱代表細胞中ROS相對水平。

1.2.5 免疫熒光檢測CD31與Nrf2在腎組織中表達：取切片，加入特丁基對苯二酚及0. 25%曲拉通(Triton X-100)處理透化后，加入一抗(兔抗鼠Nrf2、小鼠抗大鼠CD31，(1∶200))4 ℃孵育過夜，加入二抗(TRITC標記的山羊抗兔IgG、FITC標記的山羊抗小鼠IgG，稀釋倍數(shù)為1∶200)孵育顯色后，用防猝滅液封片后于激光共聚焦顯微鏡下觀察，拍照。

1.2.6 免疫組化法檢測腎組織HO-1、eNOS陽性表達：抗原修復后，加入一抗抗體(HO-1、eNOS，1∶500)室溫孵育過夜后，加入羊抗兔二抗(1∶1 000)室溫孵育后，加DAB顯色、蘇木精復染封片后于光鏡下拍照，隨機取5個視野，觀察腎組織血管染色情況，并采用Image Pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)分析被染成棕黃色的區(qū)域域面積，結果以5個視野陽性表達的平均吸光度值表示。

1.2.7 Western blot檢測大鼠腎組織ANGPTL6、MCP-1蛋白表達水平：將-80 ℃凍存的腎組織，4 ℃解凍后，于冰上用組織勻漿器勻漿，離心分離后，用蛋白提取試劑盒提取蛋白，BCA法檢測蛋白濃度后，取50μL進行電泳和轉膜反應，并加入一抗(ANGPTL6、MCP-1(1∶1 000)，β-actin(內參，1∶2 000)抗體4 ℃孵育過夜，加入HRP標記的羊抗兔二抗溶液(1∶2 000)室溫孵育4 h，用化學發(fā)光法顯色，以化學發(fā)光儀觀察條帶并拍照。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 黃芪甲苷Ⅳ對大鼠一般行為的影響

假手術組大鼠無死亡。模型組、黃芪甲苷+Nrf2抑制劑組有3只死亡，大鼠形體消瘦、生長緩慢，飲食較少。黃芪甲苷低、高劑量組大鼠給藥期間無死亡，且體重減輕及飲食減少現(xiàn)象有所改善。Nrf2抑制劑組有5只死亡，且體質量減輕、飲食減少現(xiàn)象進一步加重。

2.2 黃芪甲苷Ⅳ對大鼠血清Scr、BUN、β2-MG水平的影響

與假手術組相比，模型大鼠血清Scr、BUN、β2-MG水平升高(P<0.05)。與模型組相比，黃芪甲苷低、高劑量組大鼠血清Scr、BUN、β2-MG水平回降(P<0.05)，且高劑量組優(yōu)于低劑量組；Nrf2抑制劑組大鼠血清Scr、BUN、β2-MG水平升高(P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠血清Scr、BUN、β2-MG水平

2.3 黃芪甲苷Ⅳ對大鼠腎組織病理損傷的影響

假手術組大鼠腎小管毛細血管周結構正常；與假手術組相比，模型組大鼠腎小管周毛細血管管腔紅細胞聚集、內皮細胞腫脹及增大、管腔狹窄及受壓明顯；與模型組相比，Nrf2抑制劑組腎小管周毛細血管管腔紅細胞聚集、內皮細胞腫脹及增大進一步增加；黃芪甲苷低、高劑量組大鼠上述病理損傷減輕明顯，且隨黃芪甲苷劑量增加上述病理損傷改善越顯著；黃芪甲苷+Nrf2抑制劑組上述病理損傷與模型組相近(圖1)。

2.4 黃芪甲苷Ⅳ對大鼠腎組織ROS水平的影響

與假手術組相比，模型組大鼠腎組織ROS水平升高(P<0.05)。與模型組相比，黃芪甲苷低、高劑量組大鼠腎組織ROS水平回降(P<0.05)，且隨劑量升高其回降越明顯；Nrf2抑制劑組大鼠腎組織ROS水平升高(P<0.05)(圖2，表2)。

A.sham operation group; B.model group; C.astragaloside Ⅳ low dose group; D.astragaloside Ⅳ high dose group;E.Nrf2 inhibitor group; F.astragaloside Ⅳ + Nrf2 inhibitor group

表2 各組大鼠腎組織ROS水平比較

2.5 黃芪甲苷Ⅳ對大鼠血清TNF-α、IL-6水平的影響

與假手術組相比，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05)。與模型組相比，黃芪甲苷低、高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6水平回降(P<0.05)，且隨劑量升高其回降越明顯；Nrf2抑制劑組大鼠血清TNF-α、IL-6升高(P<0.05)(表3)。

表3 黃芪甲苷Ⅳ對大鼠血清TNF-α、IL-6水平的影響

2.6 黃芪甲苷Ⅳ對大鼠腎組織Nrf2及CD31陽性共表達的影響

與假手術組相比，模型組大鼠腎組織Nrf2+CD31+水平升高(P<0.05)。與模型組相比，黃芪甲苷低、高劑量組大鼠腎組織Nrf2+CD31+水平進一步升高(P<0.05)，且隨劑量升高其升高越明顯； Nrf2抑制劑組大鼠血清Nrf2+CD31+水平回降(P<0.05)(圖3，表4)。

表4 大鼠腎組織Nrf2及CD31陽性表達的影響

2.7 黃芪甲苷Ⅳ對大鼠腎組織HO-1及VEGF陽性表達的影響

假手術組大鼠腎小管上皮細胞區(qū)域、腎小球內皮細胞區(qū)域及腎小球系膜細胞區(qū)域HO-1及eNOS染色較弱。與假手術組相比，模型組大鼠腎組織上述區(qū)域eNOS及HO-1陽性表達升高(P<0.05)；與模型組相比，黃芪甲苷低、高劑量組大鼠腎組織eNOS陽性表達降低(P<0.05)，HO-1陽性表達升高(P<0.05)，且黃芪甲苷劑量越高上述指標變化越明顯；Nrf2抑制劑組eNOS陽性表達升高(P<0.05)，HO-1陽性表達降低(P<0.05)(圖4，表5)。

表5 大鼠腎組織HO-1及eNOS陽性表達水平比較Table 5 Comparison of HO-1 and eNOS positive expression levels in rat

A.sham operation group; B.model group; C.astragaloside Ⅳ low dose group; D.astragaloside Ⅳ high dose group; E.Nrf2 inhibitor group; F.astragaloside Ⅳ+Nrf2 inhibitor group

2.8 黃芪甲苷Ⅳ對大鼠腎組織ANGPTL6、MCP-1蛋白表達的影響

與假手術組相比，模型組大鼠腎組織ANGPTL6、MCP-1表達升高(P<0.05)。與模型組相比，黃芪甲苷低、高劑量組大鼠腎組織ANGPTL6、MCP-1表達回降(P<0.05)，且黃芪甲苷劑量越高上述指標變化越明顯；Nrf2抑制劑組大鼠腎組織ANGPTL6、MCP-1表達升高(P<0.05)(圖5，表6)。

表6 各組大鼠腎組織ANGPTL6、MCP-1蛋白表達水平比較Table 6 Comparison of protein expression levels of ANGPTL6 and MCP-1 in renal tissues of rats in each group

3 討論

腎血管微循環(huán)結構或功能損壞可引起腎小球、腎小管及腎間質損害[8]。低氧條件及炎性刺激下，腎小管周毛細血管更易受到損害[9]。尿毒癥患者血液中Scr、BUN、β2-MG等毒素大量積聚，是導致血管內皮功能失調的主要原因[10]。另外，尿毒癥患者體內炎性因子IL-6、TNF-α升高，可促進紅細胞在毛細血管管腔積聚、引起血管內皮功能損傷、導致腎毛細血管血流中斷，而加重腎損傷[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清Scr、BUN、β2-MG等毒素及炎性因子IL-6、TNF-α升高的同時，腎小管周毛細血管管腔紅細胞聚集、內皮細胞腫脹及增大等腎血管病變加重，預示模型造模成功。

A.sham operation group; B.model group; C.astragaloside Ⅳ low dose group; D.astragaloside Ⅳ high dose group; E.Nrf2 inhibitor group; F.astragaloside Ⅳ + Nrf2 inhibitor group

A.sham operation group; B.model group; C.astragaloside Ⅳ low dose group; D.astragaloside Ⅳ high dose group; E.Nrf2 inhibitor group; F.astragaloside Ⅳ+Nrf2 inhi-bitor group圖5 Western blot檢測各組大鼠腎組織ANGPTL6、MCP-1蛋白的表達Fig 5 Western blot of ANGPTL6 and MCP-1 protein expression in renal tissue of rats in each group

炎性因子TNF-α、IL-6還可激活細胞外信號調節(jié)激酶(ERK) 通路激活來調控炎癥及氧化應激反應，并促進血管內皮及組織損傷。炎性因子及氧化應激均可促進腎組織及內皮細胞釋放ANGPTL6，并通過激活ERK-eNOS信號通路，來促進內皮細胞釋放NO，誘導腎小球及腎小管血管內皮細胞釋放MCP-1來誘導炎性細胞聚集，從而加重腎臟血管病變[12]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腎組織中ANGPTL6、MCP-1表達升高的同時，eNOS表達也明顯升高，提示ANGPTL6/eNOS/MCP-1可能與腎血管內皮損傷關系密切。

Nrf2//HO-1通路是抵御外界炎性反應及氧化應激的防御性傳導通路，且與腎損傷關系密切。研究證實，ERK磷酸化，可促進Nrf2釋放并激活抗氧化酶如HO-1表達，來抑制ROS水平升高，發(fā)揮抗氧化反應[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠Nrf2/HO-1在血管內皮細胞中表達升高，而用Nrf2/HO-1通路抑制劑阻斷Nrf2/HO-1表達后，大鼠死亡、腎組織炎性損傷、腎血管病變進一步加重，提示抑制Nrf2/HO-1通路活化，可加重腎血管內皮損傷。黃芪甲苷Ⅳ對腎臟具有保護作用，能抑制體外培養(yǎng)的人血管內皮細胞凋亡[15]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著黃芪甲苷Ⅳ劑量的升高，大鼠腎組織Nrf2/HO-1激活；大鼠腎組織炎性及氧化應激損傷、腎血管內皮損傷緩解越明顯，提示黃芪甲苷Ⅳ發(fā)揮抗尿毒癥腎損傷作用，可能與激活Nrf2/HO-1通路有關。Nrf2抑制劑可逆轉黃芪甲苷Ⅳ上述作用。

綜上所述，黃芪甲苷Ⅳ可能通過促進Nrf2/HO-1通路介導的抗炎、抗氧化途徑激活，減輕尿毒癥大鼠腎血管內皮損傷。為闡明黃芪甲苷保護尿毒癥腎損傷的機制提供了新的可能機制，但尿毒癥腎血管內皮損傷的機制復雜，還涉及自噬過程，黃芪甲苷Ⅳ保護尿毒癥腎血管損傷的其他可能機制還有待進一步深入研究。