參麥注射液促進心肌梗死模型大鼠心肌血管新生

曾玉玲，李世閣, 占德進

(寧德師范學院附屬寧德市醫院 心血管內科， 福建 寧德 352100)

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是心肌急性、持續性缺血缺氧引發的心肌壞死，發病率、病死率均較高[1]。目前該病治療以靜脈溶栓及冠狀動脈介入術、搭橋術為主，但多數因冠狀動脈彌漫性病變、多器官功能衰竭等原因未能在有效時間窗內接受再灌注治療，延誤病情[2]。血管新生可增加心肌血流量，建立側支循環，改善缺血癥狀，故治療性血管新生已成為治療該病的重要目標[3]。參麥注射液(Shenmai injection)可養陰生津、益氣固脫，已有研究證實其在MI中的功效[4]，但關于其對該病心肌血管新生的促進作用及相關機制尚不明確。本研究建立MI大鼠模型，觀察參麥注射液促進該病心肌血管新生的作用，并探討相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料：SPF級SD雄性大鼠65只，8周齡，體質量(230±20)g[中國科學院上海藥物研究所，使用許可SYXK(滬)2019-0032]。

1.1.2 藥物、主要試劑：參麥注射液(云南植物藥業有限公司)；依那普利片劑(江蘇常州制藥廠有限公司)；血管性假血友病因子(von Willebrand Factor,vWF，vWF)一抗、兔抗山羊IgG二抗、小鼠抗大鼠α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)單抗、山羊抗小鼠熒光二抗(上海研啟生物科技有限公司)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒(Thermo Fisher Scientifical公司)；兔抗大鼠磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatei-dylinositol 3 kinase，PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)、p-AKT、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)單抗，山羊抗兔IgG二抗(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：65只大鼠中隨機選取55只以冠狀動脈結扎法建立MI模型[5]。麻醉后切開頸部氣管，連接呼吸機，至呼吸頻率80次/min后開胸。左側胸骨旁5 mm斜切，左前胸廓旁第4肋間開胸，暴露心臟，開胸器固定，分離心包，向下輕按心臟，6～0號絲線穿過左心耳與肺動脈圓錐交界，左冠狀動脈前降支近端結扎。結扎瞬間左心室前壁光澤消失變為暗灰色，結扎遠端心肌收縮力減弱或消失即為造模成功。41只建模成功且存活大鼠隨機分為模型組、低和高劑量組，各10只、陽性組11只。其余10只均經歷上述手術過程，但絲線從冠狀動脈下穿過不結扎。術后腹腔注射青霉素。參麥注射液臨床肌內注射用量2～4 mL/次，根據人、大鼠體表面積比例換算為等效劑量0.21～0.42 mL/kg，結合前期實驗及相關文獻確定低、高劑量組用量為1、2 mL/kg[6]，術后第2天用5%葡萄糖溶液稀釋，5 mL/kg腹腔注射，同時0.9%氯化鈉溶液5 mL灌胃；陽性組用依那普利片劑干預[7]，根據人、大鼠的體表面積比例換算為等效劑量2 mg/kg，溶于0.9%氯化鈉溶液5 mL灌胃，同時5%葡萄糖溶液5 mL/kg腹腔注射；假手術組、模型組5%葡萄糖溶液5 mL/kg腹腔注射，同時0.9%氯化鈉溶液5 mL灌胃。1次/d。連續2周。

1.2.2 HE染色觀察心肌組織病理變化：末次腹腔注射后4 h每組脫頸處死10只大鼠，迅速分離、切除心肌組織。每組5只心肌組織用40%多聚甲醛固定，病理切片機連續切片，HE染色，顯微鏡下觀察心肌病理變化，其余5只心肌組織冷凍保存。

1.2.3 免疫組織化學染色觀察梗死周圍區毛細血管密度：取心肌組織切片，滴加vWF一抗、兔抗山羊IgG二抗。DAB染色，蘇木精復染，倒置相差顯微鏡拍照，隨機選取5個視野，計算每個視野毛細血管數目。

1.2.4 免疫熒光染色觀察梗死周圍區小動脈密度：取心肌組織切片，滴加a-SMA一抗、山羊抗小鼠熒光二抗。DAB染色，蘇木精復染，倒置相差顯微鏡拍照，隨機選取5個視野，計算每個視野小動脈數目。

1.2.5 Western blot檢測各組PI3K、AKT、p-AKT、VEGF蛋白表達量：取心肌組織，裂解液裂解，BCA法定量蛋白，取測樣本與等量上樣緩沖液混合，SDS-PAGE分離，轉膜，封閉2 h，加兔抗大鼠PI3K、AKT、p-AKT、VEGF一抗，4 ℃過夜，加山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1 h，暗室顯影，以目的條帶與β-actin吸光度(A)值比值表示蛋白表達量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 一般情況

模型組拱背站立，呼吸急促，容易激惹，對外界刺激敏感，毛色發黃且蓬松豎立，低、高劑量組、陽性組經干預有所改善。

2.2 心肌組織病理變化情況

模型組心肌細胞排列紊亂，明顯肥大，嵴變寬；低和高劑量組，陽性組心肌細胞排列較為致密、整齊，細胞核為橢圓形，嵴間隙變窄，陽性組改善最為明顯，其次為高劑量組，最后為低劑量組(圖1)。

2.3 MI周圍區毛細血管密度

與假手術組比較，模型組毛細血管、小動脈密度均增加(P<0.05)；與模型組比較，低和高劑量組、陽性組毛細血管、小動脈密度均進一步增加(P<0.05)(圖2～3，表1)。

表1 MI區毛細血管密度

2.4 PI3K、VEGF蛋白表達量及p-AKT/AKT

與假手術組比較，模型組PI3K、VEGF蛋白表達量，p-AKT/AKT均升高(P<0.05)，與模型組比較，低劑量組、高劑量組、陽性組均進一步升高(P<0.05)(圖4，表2)。

A.sham operation group; B.model group; C.low-dose group; D.high-dose group; E.positive group圖1 心肌組織病理變化(HE染色)Fig 1 Pathological changed of myocardial tissue(scale bar=150 μm)

A.sham operation group; B.model group; C.low-dose group; D.high-dose group; E. positive group圖2 免疫組織化學染色檢測各組心肌組織vWF表達

A.sham operation group; B.model group; C.low-dose group; D.high-dose group; E. positive group圖3 免疫熒光染色檢測各組心肌組織α-SMA表達

表2 PI3K、VEGF蛋白表達量及p-AKT/AKT比較

A.sham operation group; B.model group; C.low-dose group; D.high-dose group; E.positive group圖4 Western blot檢測各組心肌組織PI3K、AKT、p-AKT、VEGF蛋白表達Fig 4 Western blot analysis of PI3K, AKT, p-AKT, VEGF protein expression in myocardial tissues in each group

3 討論

MI是常見心血管系統疾病，臨床認為其發病機制與脂類代謝、炎性反應、斑塊血流動力學及血小板等因素互相作用，導致不穩定冠狀動脈斑塊破裂有關[8]。MI面積、心功能改變、心室重構程度與梗死區域血管新生、側支循環關系密切。血管新生可改善心肌缺血，避免缺血鈍抑性心肌壞死及凋亡，并可增加正常心肌細胞供氧，抑制心肌細胞代償性肥大后的凋亡，產生再生性代償。

本研究顯示，低和高劑量組，陽性組病理變化改善效果依次增強，MI周圍區毛細血管、小動脈密度依次增加，提示參麥注射液可改善MI大鼠病理變化，促進心肌血管新生，且呈劑量依賴性。參麥注射液由紅參與麥冬制成，可滋陰生津、救逆固脫、益氣復脈。現代藥理學證實[9]，參麥注射液中有效成分人參皂苷及麥冬多糖可增強心肌收縮力及缺氧耐受力，增加冠狀動脈血流量，并促進ATP合成，實現心肌缺血再灌注，同時拮抗自由基氧化。有學者研究顯示[10]，參麥注射液可改善MI大鼠心功能，減輕心肌纖維化程度，本研究結論與其相似。

PI3K是一種對磷脂酰肌醇D3位的脂類激酶，AKT是其信號通路下游關鍵效應分子，磷酸化后可進入胞質與胞核中，發揮促細胞增殖、拮抗凋亡等級聯反應。VEGF是血管內皮細胞的促有絲分裂劑，在血管新生過程中起到重要作用。有研究指出[11]，PI3K/AKT信號通路可能通過抑制心肌細胞凋亡、介導血管生成、促進細胞能量代謝等方面參與MI發病進程。本研究顯示陽性組、高和低劑量組的PI3K、VEGF表達依次降低，提示參麥注射液促進MI血管新生可能與激活PI3K/AKT信號通路有關。

綜上所述，參麥注射液可促進MI大鼠心肌血管新生，且呈劑量依賴性，推測與激活PI3K/AKT信號通路有關。