miR-26a靶向IGF-1抑制子宮肌瘤細胞增殖、遷移和侵襲

向雪芹，崔權哲，童玉娜，詹文斌，陸 靜*

(成都市第三人民醫院 1. 婦產科； 2. 病理科； 3. 藥劑科， 四川 成都 610014)

子宮肌瘤(uterine leiomyoma)是常見的婦女生殖系統腫瘤，近些年該病的發病率逐年升高，是引起子宮切除的一個主要原因[1]。子宮肌瘤細胞受到刺激后的異常增殖、遷移和侵襲是其發生發展的主要原因[2]，因此，探究影響子宮肌瘤細胞增殖的分子機制具有重要意義。越來越多的研究表明，微小RNA(microRNA，miRNA)在多種腫瘤發生發展中有重要作用，其異常表達與疾病進展有關[3-4]。miR-26a是miRNAs成員之一，子宮肌瘤組織中miR-26a表達下調，其高表達miR-26a可抑制肌瘤細胞增殖能力，阻滯細胞周期[5]。胰島素樣生長因子1(insulin like growth factor 1，IGF-1)的結構與胰島素相似，對細胞增殖、分化等有重要作用，與腫瘤發生密切相關[6]。IGF-1在子宮肌瘤組織中過度表達，提示IGF-1可能影響子宮肌瘤細胞增殖[7]。miR-26a是否可調控IGF-1影響子宮肌瘤細胞增殖尚未明確。因此，本研究旨在分析miR-26a靶向IGF-1對子宮肌瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響，并進一步研究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本的采集：隨機選擇2018年9月至2019年6月在成都市第三人民醫院婦產科因子宮肌瘤住院且行子宮切除術或肌瘤剔除術的患者6例，所有患者月經規律，且無內外科合并癥，年齡38～48歲，平均年齡為(42.8±2.7)歲。所有的患者在術前3個月均無激素類藥物治療史，且術后經病理證實為子宮肌瘤。所有采集的樣本均經過患者的同意，并簽訂知情同意書。獲得成都市第三人民醫院倫理委員會批準(倫理批號:20180712)。

1.1.2 主要試劑：胎牛血清、DMEM培養基(Gibco公司)；RNA試劑盒、脂質體LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)；PCR試劑盒、反轉錄試劑盒(美國ABI)；miR-26a模擬物(mimics)及模擬陰性序列(miR-NC)、miR-26a抑制物(anti-miR-26a)及陰性序列(anti-miR-NC)、IGF-1過表達載體(pcDNA3.1-IGF-1)及空載體(pcDNA3.1)均由上海生工合成；MTT、DMSO(Sigma-Aldrieh公司)；Transwell小室(Corning公司)；熒光素酶活性檢測試劑盒(Promega公司)；IGF-1、增殖細胞核抗原(PCNA)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和基質金屬蛋白酶2(MMP-2)抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 人子宮平滑肌瘤細胞(leiomyoma cell)的分離培養：用眼科剪將每塊標本剪成約1 cm×1 cm×1 cm大小，用巴氏滴管轉移DMEM及組織至離心管中，1 000 r/min離心5 min，離心后將上清去除。加入Ⅰ型膠原酶，封口以防止污染，37 ℃恒溫水浴搖床中消化，每間隔1 h使用300目不銹鋼細胞濾網過濾1次，約消化3～5 h后終止消化，1 000 r/min離心5 min，去上清。臺盼藍拒染試驗檢測細胞的成活率。適量DMEM培養液(含10%胎牛血清)懸浮沉淀，于37 ℃、飽和濕度、5%體積分數CO2培養箱中培養。貼壁過夜后，更換培養液，此后每3 d換液1次。顯微鏡下觀察到培養瓶壁上細胞鋪滿80%～90%時，即可進行傳代。取增殖至對數期的細胞用于實驗研究。

1.2.2 細胞的分組和處理：轉染前1 d，將對數期的子宮肌瘤細胞接種于6孔板中，2×105個/孔，細胞達70%匯合度后進行轉染。轉染參照說明進行操作。將LipofectamineTM2000與待轉染物混勻，制備成復合物，將復合物加入6孔板相應孔內，于37 ℃、5%體積分數CO2培養箱孵育6 h，更換含有血清的培養基，繼續培養細胞48 h，用于后續實驗研究。細胞分為miR-26a組(轉染miR-26a mimics)、miR-NC組(轉染miR-NC)、anti-miR-26a組(轉染anti-miR-26a)、anti-miR-NC組(轉染anti-miR-NC)、(pcDNA3.1-IGF-1)組(轉染pcDNA3.1-IGF-1)、(miR-26a+IGF-1)組(轉染miR-26a mimics+pcDNA3.1-IGF-1)、對照組(未轉染細胞)。

1.2.3 RT-qPCR檢測miR-26a表達：用總RNA試劑盒提取細胞總RNA，紫外分光光度計檢測RNA濃度及質量后，依照反轉錄試劑盒說明反轉錄為cDNA。依照qPCR試劑盒說明配置反應體系，體系為20 μL，反應條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環。反應結束后，以U6作為內參基因，用公式2-△△Ct計算miR-26a mRNA相對表達量。每個樣本設置5個復孔，實驗重復3次。

1.2.4 MTT比色法檢測細胞活力：接種子宮肌瘤細胞于96孔板，接種為5×104/mL，100 μL/孔，于37 ℃、飽和濕度、5%體積分數CO2培養箱中孵育，觀察到細胞完全貼壁后，分別在轉染的24、48和72 h，在每孔中加20 μL MTT液(5 mg/L)，于培養箱內孵育4 h，棄掉上清，PBS洗滌細胞，然后在每孔中加DMSO 150 μL，置于搖床上低速震蕩10 min溶解形成的結晶，在490 nm波長下，采用酶標儀檢測吸光度(A)值，實驗重復3次。

1.2.5 Transwell小室法檢測細胞遷移及侵襲能力：在Transwell小室檢測細胞侵襲實驗前，預先在小室上層鋪30 μL基質膠。小室上室接種按照上述操作轉染48 h的細胞(約5×104個)，下室裝培養基(含10%胎牛血清)，于培養箱內孵育24 h，甲醇固定，結晶紫染色，棉簽輕輕擦除上室內貼附于濾膜上的細胞，顯微鏡下隨機選擇5個區域進行細胞計數。取均值，實驗重復3次。細胞遷移能力檢測除了未鋪基質膠外，其他操作與檢測細胞侵襲步驟一致。實驗重復3次。

1.2.6 熒光素酶報告基因實驗驗證miR-26a與IGF-1靶向關系：通過靶基因預測軟件發現 miR-26a與IGF-1的3′UTR有可結合的位點，構建IGF-1的3′UTR雙熒光報告質粒，即IGF-1野生型(IGF-1-WT)和IGF-1突變型(IGF-1-MUT)質粒，并與 miR-26a共轉染至子宮肌瘤細胞，參照熒光素酶活性檢測試劑盒說明書，按照步驟檢測子宮肌瘤細胞熒光素酶活性，從而驗證 miR-26a與IGF-1的靶向關系。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海參熒光素酶活性值。實驗重復3次。

1.2.7 Western blot檢測蛋白表達：提取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。按照20～30 μg/孔上樣，經 SDS-PAGE分離蛋白，轉PVDF膜，5%的脫脂奶粉封閉膜，膜封閉2 h，加一抗(1∶500稀釋的IGF-1、PCNA、E-cadherin、MMP-2抗體)，4 ℃孵育過夜，洗膜，加二抗，37 ℃搖床震蕩封閉1 h。ECL顯色，Bio-Rad曝光儀曝光，Quantity One軟件定量蛋白。實驗重復3次。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 miR-26a過表達轉染效率

miR-26a組miR-26a表達(7.462±0.553)明顯高于對照組(1.000±0.100)(P<0.05)。

2.2 miR-26a對子宮肌瘤細胞增殖的影響

miR-26a組細胞在24～72 h 的細胞增殖均明顯低于空白組(P<0.05)(表1)。

表1 miR-26a對子宮肌瘤細胞增殖的影響

2.3 miR-26a對子宮肌瘤細胞遷移和侵襲的影響

miR-26a 組和空白組比較，細胞遷移和侵襲能力均明顯降低(P<0.05)(表2)。

表2 miR-26a對子宮肌瘤細胞遷移和侵襲的影響

2.4 靶基因預測

靶基因預測軟件發現 miR-26a和IGF-1的3′UTR存在結合位點(圖1A)。miR-26a mimics可明顯降低IGF-1-WT的熒光素酶活性(P<0.05)(表3)。miR-26a組IGF-1表達明顯低于miR-NC組，而anti-miR-26a組IGF-1表達明顯高于anti-miR-NC組(P<0.05)(圖1B，表4)。

表3 雙熒光素酶檢測結果Table 3 Double luciferase detection n=3)

表4 抑制或過表達miR-26a后子宮肌瘤細胞IGF-1表達

圖1 miR-26a靶向調控IGF-1表達Fig 1 miR-26a targeted regulation of IGF-1 expression

2.5 過表達IGF-1可以緩解過表達miR-26a對子宮肌瘤細胞增殖、遷移及侵襲影響

與(miR-26a+pcDNA3.1)組比較，(miR-26a+IGF-1)組細胞增殖、遷移及侵襲能力均明顯升高(P<0.05)(表5)。

表5 過表達miR-26a和IGF-1對子宮肌瘤細胞增殖、遷移及侵襲影響

2.6 過表達IGF-1可緩解miR-26a對子宮肌瘤細胞PCNA、E-cadherin、MMP-2表達的影響

與miR-NC組比較，miR-26a組PCNA和MMP-2表達明顯降低，E-cadherin表達明顯升高(P<0.05)；與(miR-26a+pcDNA3.1)組比較，(miR-26a+IGF-1)組PCNA和MMP-2表達明顯升高，E-cadherin表達明顯降低(P<0.05)(圖2,表6)。

圖2 過表達miR-26a和IGF-1對子宮肌瘤細胞增殖、遷移和侵襲相關蛋白表達的影響Fig 2 Effects of miR-26a and IGF-1 over-expression on the expression of proteins related to proliferation, migration and invasion of uterine leiomyoma cells

表6 PCNA、E-cadherin和MMP-2的蛋白相對表達量Table 6 Relative protein expression levels of PCNA, E-cadherin and n=3)

3 討論

miR-26a是miRNAs大家族一員，對食管癌、甲狀腺癌等多種腫瘤生長有抑制作用[8-9]。但目前miR-26a對子宮肌瘤細胞生物學行為的影響較少。前人研究表明，miR-26a高表達可抑制子宮肌瘤細胞增殖[5]，本研究中，將miR-26a模擬物轉染子宮肌瘤細胞，細胞中miR-26a表達明顯升高，提示構建的miR-26a過表達載體成功，進一步的細胞生物學特性研究顯示，過表達miR-26a可明顯抑制子宮肌瘤細胞增殖、遷移和侵襲，提示miR-26a對子宮肌瘤細胞的惡性增殖、遷移和侵襲行為具有抑制作用。

IGF-1由肝臟分泌，是一種多功能的細胞調控因子，對機體生長發育有促進作用。有研究發現，在子宮肌瘤組織中IGF-1高表達，雌激素可促進IGF-1對細胞增殖促進作用[10]。體外研究發現，性激素缺乏時IGF-1對細胞有絲分裂也有促進作用，促進細胞增殖，進而引起子宮肌瘤的發生發展[11]。有研究顯示，miR-26a可通過靶向IGF-1抑制骨肉瘤細胞增殖[12]。本研究通過雙熒光素酶實驗證實miR-26a和IGF-1存在靶向關系。進一步的研究發現，過表達IGF-1可減弱miR-26a對子宮肌瘤細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。提示miR-26a可靶向IGF-1影響子宮肌瘤細胞惡性增殖、遷移和侵襲行為。

PCNA是一種DNA聚合酶的輔酶，可直接參與DNA合成，與細胞增殖存在密切關系，其含量可反映出細胞增殖活性[13]。上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)對腫瘤侵襲轉移起到關鍵作用，E-cadherin是鈣黏附蛋白家族成員之一，其表達缺失或減少可促進細胞的遷移及侵襲[14]。MMPs是細胞外重要的基質降解酶，在腫瘤遷移和侵襲中發揮重要作用，MMP-2是MMPs中重要的一種，有研究顯示，下調MMP-2可抑制子宮肌瘤細胞遷移和侵襲[15]。本研究結果顯示，過表達miR-26a可抑制PCNA和MMP-2表達，促進E-cadherin表達，而過表達IGF-1可減弱miR-26a對PCNA和MMP-2表達抑制及E-cadherin表達促進作用。提示miR-26a可靶向IGF-1影響子宮肌瘤細胞PCNA、MMP-2和E-cadherin表達。

綜上所述，在子宮肌瘤細胞過表達miR-26a可抑制細胞增殖、遷移和侵襲能力，作用機制可能與調控IGF-1表達有關，對子宮肌瘤細胞增殖、遷移和侵襲影響可能與調節PCNA、MMP-2和E-cadherin表達有關。miR-26a/IGF-1可能為子宮肌瘤治療提供了潛在的靶點。