AMPK激活劑減輕重癥急性胰腺炎模型大鼠胰腺損傷

黃 偉，孔麗君，葉亞群，王宏偉

(溫州醫科大學附屬第一醫院 1.營養科；2. 浙江省胰腺肝臟危重病診治新技術研究重點實驗室；3.手術室，浙江 溫州 325000)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)的發病率為0.5‰～8‰，其中20%發展為重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)[1-2]；SAP在發病早期就可以激活細胞因子級聯反應信號通路，誘導炎性因子釋放，炎性因子又與內毒素響應，導致患者產生全身性炎性和氧化應激反應，細胞能量供應嚴重不足，最終發展為多器官功能衰竭。因此，保證細胞能量供應能有效抑制炎性與氧化應激反應，是治療SAP的重要突破口[3]。

磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)是三聚體絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，被認為是調節細胞能量代謝的開關。激活的AMPK可減少ATP消耗和增加ATP產生，滿足細胞能量需要以應對各種應激反應[4-6]。本文旨在探討應用AMPK激活劑5-氨基-4-咪唑羧基酰胺核苷(5-amino-4-imidazolecarboxamide riboside，AICAR)通過激活AMPK磷酸化，調節細胞能量代謝，抑制炎性反應和氧化應激反應，從而發揮保護SAP大鼠胰腺損傷的作用，為AMPK 激活劑應用于臨床治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：SPF級雄性SD大鼠18只，體質量200～220 g，由溫州醫科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(浙)2020-0001。動物飼養在溫度24 ℃±1 ℃、相對濕度50%±1%、每天光照及黑暗時間各12 h的環境下，自由飲水，自由進食，兩只分1籠飼養。所有動物研究(包括執行安樂死)均按照溫州醫科大學動物保健機構及根據國際實驗動物飼養評估認證協會(AAALAC)和中國科學院生化與細胞所實驗動物管理委員會(IACUC)指南進行。

1.1.2 試劑及試劑盒：抗AMPK和P-AMPK抗體(Cell Signaling Technology公司)；抗單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)和髓過氧化物酶(MPO)抗體(Abcam公司)；AICAR(每瓶25 mg，Med Chem Express公司)；牛黃膽酸鈉(Sigma-Aldrich公司)；超氧化物歧化酶(SOD)和胰腺組織丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成生物技術有限公司)；IL-6和TNF-α測定試劑盒(上海博蘊生物技術有限公司)；HE染色試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)。使用均按說明書操作。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：將大鼠隨機分為假手術組(NC組)、模型組(SAP組)和實驗組(SAP+AICAR)組，造模前2 h給予AICAR 400 mg/kg干預)，用異氟烷麻醉(4%誘導，3%維持)后，5%牛黃膽酸鈉按0.1 mL/kg泵入膽管造模；每組6只大鼠。造模24 h后各組大鼠均無死亡。用異氟烷麻醉大鼠，取腹主動脈血5～7 mL，并剪除心臟使大鼠安樂死；收集血清和胰腺組織用于后續檢測。

1.2.2 蛋白質印跡：測定胰腺組織p-AMPK和AMPK表達水平[7]。

1.2.3 HE染色:將胰腺用4%甲醛固定，脫水，用石蠟包埋。胰腺用石蠟切片機制備厚度5 μm的組織切片，脫蠟，HE染色，光鏡下觀察胰腺病理損傷程度(改良Schmidt法對胰腺損傷的程度進行評分)和水腫程度。

1.2.4 免疫組織化學染色:胰腺組織切片經脫蠟，3% H2O2溶液處理10 min和山羊血清封閉30 min后，分別用稀釋系數為1∶200的抗MCP-1和抗MPO抗體孵育過夜；經洗滌，再用山羊抗兔二抗對組織切片37 ℃孵育30 min洗滌后，加入DAB(diaminobenzidine)測定MCP-1表達量和MPO陽性細胞數量。

1.2.5 ELISA:測定大鼠血清淀粉酶、脂肪酶、IL-6和TNF-α。

1.2.6 黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法:SOD采用黃嘌呤氧化酶法測定，MDA采用硫代巴比妥酸法測定，檢測均按試劑盒說明書操作。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 AICAR顯著激活SAP大鼠胰腺組織AMPK磷酸化

SAP組磷酸化AMPK水平較NC組明顯降低(P<0.05)。實驗組磷酸化AMPK水平較SAP組明顯升高(P<0.01)(圖1)。

2.2 AICAR減輕SAP大鼠胰腺組織損傷和胰腺水腫程度

SAP組胰腺腺泡細胞腫脹、分布紊亂、存在炎性細胞浸潤；SAP+AICAR組胰腺腺泡細胞腫脹、分布紊亂、炎性細胞浸潤情況較SAP組明顯改善(圖2A)。SAP組胰腺病理評分和胰腺水分含量均明顯高于NC組(P<0.01)，實驗組胰腺病理評分和水分含量均明顯明顯低于SAP組(P<0.01)(圖2B，C)。

2.3 AICAR抑制SAP大鼠胰腺組織炎性細胞浸潤

SAP組MCP-1蛋白表達量和MPO陽性細胞數量明顯高于NC組(P<0.01)；實驗組MCP-1蛋白表達量和MPO陽性細胞數量均明顯低于SAP組(P<0.01)(圖3)。

*P<0.05 compared with NC group； #P<0.01 compared with SAP group圖1 胰腺組織中AMPK和p-AMPK的表達Fig 1 Expression of AMPK and p-AMPK in pancreatic

*P<0.01 compared with NC group；#P<0.01 compared with SAP group圖2 AICAR減輕SAP大鼠胰腺組織損傷和胰腺水腫程度Fig 2 AICAR alleviated pancreatic tissue injury and pancreatic edema in SAP

2.4 AICAR減輕SAP大鼠胰腺損傷和抑制炎性因子釋放

SAP組大鼠血清淀粉酶、脂肪酶、IL-6和TNF-α含量均明顯高于NC組(P<0.01)；實驗組大鼠血清淀粉酶、脂肪酶、IL-6和TNF-α含量均明顯低于SAP組(P<0.01)(表1)。

表1 AICAR減輕SAP大鼠胰腺損傷并抑制炎性因子釋放Table 1 AICAR alleviated pancreatic injury and inhibited the release of inflammatory factors in SAP

2.5 AICAR抑制SAP大鼠胰腺組織氧化應激反應

SAP組大鼠胰腺組織中MDA含量明顯高于NC組(P<0.01),SOD活性明顯低于NC組(P<0.01)；實驗組胰腺組織中MDA含量明顯低于SAP組(P<0.01)，而SOD活性明顯高于SAP組(P<0.01)(圖4)。

3 討論

SAP是急性全身性消耗性疾病，主要表現為高分解代謝和低合成代謝狀態，能量消耗相比靜息狀態顯著增加[8]。

AICAR可激活AMPK磷酸化，調節細胞能量代謝，具有潛在的抗炎和抗細胞增殖活性功能[9]。本研究證明AICAR可激活AMPK磷酸化，使p-AMPK/AMPK比值明顯升高，調節細胞能量代謝，從而抑制SAP大鼠胰腺腺泡細胞淀粉酶和脂肪酶的釋放，減輕其胰腺病理損傷和水腫程度。

MCP-1可刺激大量自由基生成，導致巨噬細胞浸潤，加重胰腺炎性反應[6,10]。MPO在氧化應激和不同的炎性反應刺激后過度表達，是巨噬細胞和中性粒細胞激活的標志[11]。此外，AICAR能夠抑制TNF-α和IL-6等多種促炎因子釋放，減輕組織器官損傷及炎性細胞浸潤[6,12-13]。然而，AICAR是否能夠抑制重癥急性胰腺炎這種急性炎性反應，國內外還未見報道。有趣的是，本研究發現AICAR能明顯降低SAP大鼠上調的TNF-α和IL-6等促炎因子的水平，表明AICAR可有效降低炎性反應，減輕SAP大鼠胰腺的炎性細胞浸潤。

除上述炎性介質學說外，氧化應激反應在SAP的發生發展中也起著重要作用[13]。基于AICAR對SAP所致胰腺損傷的有效保護作用，據推測，AICAR可能作為一種外源性抗氧化劑對胰腺損傷具有保護作用。為了驗證猜測，本研究檢測了關鍵的內源性氧自由基MDA表達和抗氧化劑SOD的活性。結果表明，AICAR能有效降低SAP大鼠胰腺組織中上調的MDA水平并顯著上調SOD活性，從而減輕氧化應激反應，恢復SAP大鼠胰腺的抗氧化能力，保護SAP大鼠胰腺免受損傷。

綜上所述，在SAP大鼠模型中使用AMPK激活劑AICAR，可通過激活AMPK磷酸化顯著抑制SAP大鼠胰腺組織的炎性反應和氧化應激水平，從而有效減輕SAP大鼠胰腺損傷，緩解胰腺水腫，有一定的臨床應用前景和意義。

IOD.integrated optical density; HD.high powerlens; *P<0.01 compared with NC group；#P<0.01 compared with SAP group(scale bar=25 μm)

*P<0.01 compared with NC group；#P<0.01 compared with SAP group圖4 AICAR抑制SAP大鼠胰腺組織氧化應激反應Fig 4 AICAR inhibited oxidative stress in the pancreatic tissue of SAP