上調miR-125a-5p抑制急性髓系白血病細胞系的增殖和侵襲

高秋英，荀利如，李 嵐，侯麗敏，周 偉，王 暉*

(陜西省人民醫院 1.血液科; 2.腎病血透中心, 陜西 西安 710068)

急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia，AML)是造血系統的髓系原始細胞克隆性惡性增殖性疾病，是一種高度異質性疾病群[1]。中國的AML發病率在世界范圍內排名第三，而中國年輕AML患者的病死率最高[2]。因此，迫切需要開發抗AML的新療法。

微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)是一種短的非編碼RNA分子，其通過靶向mRNA的3′-非翻譯區(3′-UTR)來調節基因表達。miRNA被視為基因表達的天然調節劑。最新研究證明，miRNA可能通過靶向癌基因或腫瘤抑制因子來參與癌細胞的增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲的調控，并且對于AML的診斷和治療具有重要作用[3-4]。例如，miR-125a-5p在尿路上皮癌[5]、胃癌[6]、肺癌[7-8]中被下調并發揮抑癌作用，然而其在結腸癌[8]中被上調并發揮致癌作用。miR-125a-5p的低表達與胃癌的淋巴結轉移及預后有關，miR-125a-5p通過靶向腫瘤轉移抑制基因BRMS1發揮腫瘤抑制作用[5]。過表達miR-125a-5p可通過沉默參與致癌的KRAS和NF-κB通路的相關基因增強肺癌細胞對藥物的敏感性，并減弱細胞的侵襲性[7]。上調miR-125a-5p通過靶向NEDD9抑制肺腺癌的增殖并誘導細胞凋亡[8]。miR-125a-5p在結腸癌組織中的表達水平高于癌旁組織，其表達水平與腫瘤大小、淋巴結轉移和臨床分期顯著相關，減少miR-125a-5p可促進結腸癌細胞凋亡[9]。然而，目前尚不清楚miR-125a-5p在AML中的詳細功能和分子機制。

E3泛素蛋白連接酶TRIM71(tripartite motif containing 71，TRIM71)屬于TRIM蛋白家族[10]，TRIM71在非小細胞肺癌患者中高表達，TRIM71的表達與腫瘤大小、淋巴結轉移，TNM分期和不良預后相關。并且TRIM71可通過調節核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路促進癌細胞的增殖和轉移能力[10]。然而，目前尚不清楚TRIM71在AML中的表達模式及功能。另外，已證明NF-κB是一些惡性腫瘤中某些miRNA的靶基因，例如miRNA-223通過激活NF-κB信號通路促進肺癌進展[12]，在宮頸癌中，miR-429通過負調節NF-κB的活化發揮抗腫瘤活性[13]。

本研究考察了miR-125a-5p在AML發病機理中的功能，研究miR-125a-5p在此過程中的分子機制，并分析和驗證了miR-125a-5p的靶向調控基因，旨在為AML的診斷和治療提供候選分子靶標。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品和試劑：胎牛血清(HyClone公司)；RPMI-1640培養基(Gibco公司)；Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；MTT法測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；Matrigel(BD Biosciences公司)；結晶紫、annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、BCA蛋白質檢測試劑盒和增強化學發光(ECL)試劑(碧云天生物技術研究所)；Trizol試劑(Life Technology公司)；PrimeScriptTMRT試劑盒和SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa公司)；RIPA裂解緩沖液(Thermo Fisher Scientific公司)；PVDF膜(Millipore公司)；Bax、Bcl-2一抗及HRP標記的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG(Santa Cruz Biotechnology公司)；TRIM71、NF-κB p65一抗(Cell Signaling Technology公司)；lamin-B、β-actin一抗(Abcam公司)；pGL3熒光素酶報告載體(Promega公司)。miR-125a-5p mimic及miR-NC、pcDNA3.1-TRIM71及pcDNA3.1-NC(上海吉瑪制藥技術有限公司)。

1.1.2 AML患者骨髓標本的收集：收集2017年6月至2019年6月間陜西省人民醫院收治的性別和年齡匹配的20例AML患者[男女各10例，年齡為24～65歲，平均(41.3±11.4)歲]和20名健康受試者[男女各10例，年齡為27～58歲，平均(42.3±13.1)歲]的骨髓樣本。在收集骨髓之前AML患者未接受任何治療。通過RT-qPCR檢測骨髓標本中miR-125a-5p和TRIM71的表達。本研究方案已獲得本院倫理委員會批準[審批文號：SYL(No)：2017-0636]，所有參與者均知情同意。

1.1.3 細胞系：人正常外周血單個核細胞(peri-pheral blood mononuclear cell, PBMC)、人急性髓系白血病(AML)細胞系U937和HL60(美國典型培養物保藏中心)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分組及處理：所有細胞均常規培養在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養基中，培養環境為37 ℃、5% CO2。取處于對數增殖期的細胞用于本實驗研究。將U937或HL60細胞接種在24孔板中，孵育24 h。當細胞達到80%匯合時，根據說明書，使用Lipofectamine 2000分別將100 nmol/L的miR-125a-5p模擬物(miR-125a-5p mimic)或陰性對照(miR-NC)轉染到U937和HL60細胞中。另外，使用Lipofectamine 2000將過表達TRIM71的質粒(pcDNA3.1-TRIM71)或對照質粒(pcDNA3.1-NC)轉染到U937和HL60細胞中。在轉染后的指定時間點，收集細胞用于進一步檢測。

1.2.2 MTT法測定細胞活力：細胞轉染后，收集細胞并接種在96孔板中(每孔1×105個細胞)，然后在37 ℃下再孵育48 h。根據說明書進行MTT法測定。

1.2.3 Matrigel體外侵襲實驗測定細胞侵襲：將轉染的細胞(5×104個細胞/孔)接種到含有無血清RPMI 1640培養基的Transwell上室中，上室底部用Matrigel包被。下室中添加15% FBS的RPMI 1640。孵育36 h后，刮除未侵襲的細胞。用4%多聚甲醛固定侵襲的細胞30 min。然后將細胞在室溫下用0.1%結晶紫染色2 h。計數5個隨機視野中的侵襲細胞數量。

1.2.4 流式細胞測量術測定細胞凋亡：收集轉染后的細胞，用PBS洗滌，并在4 ℃以1 000 r/min離心10 min。然后將細胞與膜聯蛋白-V(annexin-V)在黑暗中孵育15 min，在孵育結束前5 min添加碘化丙啶(PI)并孵育5 min。離心后，使用PBS重懸細胞，并在FACS Calibur流式細胞儀上進行分析。

1.2.5 RT-qPCR檢測miR-125a-5p和TRIM71 mRNA的表達：用Trizol試劑分離骨髓標本及細胞總RNA。使用PrimeScriptTMRT試劑盒進行反轉錄。在7900HT熒光定量PCR儀上使用SYBR Premix Ex Taq進行PCR。引物序列為：miR-125a-5p，上游引物：5′-ACACTGCTCGATAGTAGGGCAGAA-3′，下游引物：5′-ATTCGAGTGTGTGAGGCCGTGGA-3′；U6，上游引物：5′-ACTTCGCACAGCATACTATA AAA-3′，下游引物：5′-GCACTTCCGTGACATCGTGTCAATTA-3′；TRIM71，上游引物：5′-CGGAGAAGGT CACCGTATCA-3′，下游引物：5′-TCCGGTCAGAC TCTTGTCTG-3′；β-actin，上游引物：5′-CGGAGAC ACGTGGACTCATA-3′，下游引物：5′-TCCGGTTCT GGGACCTTACT-3′。將miR-125a-5p的表達水平標準化為U6；將TRIM71的表達水平標準化為β-actin。通過2-ΔΔCt方法確定基因相對表達量。

1.2.6 Western blot檢測TRIM71、Bax、Bcl-2和NF-κB p65蛋白的表達：收集細胞并在RIPA裂解緩沖液中裂解。使用BCA蛋白質檢測試劑盒檢測蛋白質濃度。通過12% SDS-PAGE分離等量的蛋白質，并將其轉移至PVDF膜。在室溫下，用含0.05% Tween 20和2.5%脫脂牛奶的TBST將膜封閉1 h，然后在4 ℃下與一抗孵育過夜。一抗包括TRIM71(1∶1 000)、Bax(1∶3 000)、Bcl-2(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶5 000)、lamin-B(1∶2 000)和β-actin(1∶3 000)。用TBST洗滌3次后，將膜與HRP標記的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG在室溫下孵育1 h。使用增強化學發光(ECL)試劑進行顯影。

1.2.7 熒光素酶報告基因檢測：將TRIM713′UTR的野生型或突變型插入pGL3熒光素酶報告載體，構建pGL3-TRIM71-WT和pGL3-TRIM71-MUT質粒。接下來，使用Lipofectamine 2000將pGL3-TRIM71-WT和pGL3-TRIM71-MUT與miR-125a-5p mimic或miR-NC一起共轉染到細胞中。48 h后，使用雙熒光素酶報告基因測定系統(Promega公司)測量熒光素酶活性。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 miR-125a-5p在AML患者和AML細胞中的表達

與對照相比，AML患者骨髓中miR-125a-5p的表達水平顯著降低(P<0.05)。與PBMC相比，AML細胞(U937和HL60)中miR-125a-5p的表達水平也顯著降低(P<0.05)(圖1)。此外，取AML患者骨髓中miR-125a-5p表達水平的中位數作為截斷值，將患者分為高表達組和低表達組，未發現不同(France, American, Britian,FAB)分型患者中miR-125a-5p表達的差異。

2.2 miR-125a-5p抑制AML細胞的增殖

miR-125a-5p mimic轉染后U937和HL60細胞中miR-125a-5p的水平顯著增加(P<0.05)。與對照組相比，miR-125a-5p mimic組的細胞活力顯著降低(P<0.05)(圖2)。

2.3 miR-125a-5p抑制AML細胞的侵襲

與對照組相比，miR-125a-5p mimic組的U937和HL60細胞的侵襲率顯著降低(P<0.05)(圖3)。

2.4 miR-125a-5p誘導AML細胞凋亡

與對照組相比，miR-125a-5p mimic組的U937和HL60細胞的凋亡率顯著升高(P<0.05)(圖4)。

2.5 miR-125a-5p靶向抑制TRIM71表達

與對照組相比，AML患者骨髓中TRIM71 mRNA的表達水平顯著升高(P<0.05)；與PBMC相比， AML細胞(U937和HL60)中TRIM71 mRNA的表達水平也顯著升高(P<0.05)(圖5)。使用生物信息學工具(TargetScan)分析miR-125a-5p的潛在靶mRNA。結果顯示，TRIM71是miR-125a-5p的潛在靶標。熒光素酶報告基因檢測顯示，miR-125a-5p mimic有效抑制了pGL3-TRIM71-WT的熒光素酶活性(P<0.05)(圖6)。

A.relative expression level of miR-125a-5p in bone marrow of healthy subjects and AML patients (n=20); *P<0.05 compared with control group; B.relative expression level of miR-125a-5p in PBMC, U937 and HL60 cells (n=3); *P<0.05 compared with PBMC; #P<0.05 compared with U937

A.miR-125a-5p transfection mimic up-regulated the expression of miR-125a-5p in U937 and HL60 cells; B.effect of up-regulation miR-125a-5p on the proliferation of U937 and HL60 cells; *P<0.05 compared with control group

*P<0.05 compared with control group圖3 miR-125a-5p對AML細胞系侵襲的影響Fig 3 Effect of miR-125a-5p on the invasion of AML cell lines(scale bar=50 μm) n=3)

2.6 上調TRIM71對AML細胞的增殖、凋亡和侵襲的影響

與對照組相比，pcDNA3.1-TRIM71組的TRIM71的mRNA和蛋白表達水平均上調(P<0.05)(圖7)。與對照組相比，pcDNA3.1-TRIM71組的細胞活力和細胞侵襲率(P<0.05)顯著升高(圖8)；對照組和pcDNA3.1-TRIM71組的細胞凋亡率差異無統計學意義(P>0.05)(圖9)。

2.7 miR-125a-5p靶向TRIM71調控AML細胞的增殖、凋亡和侵襲

與miR-125a-5p mimic組相比，(miR-125a-5p mimic+pcDNA3.1-TRIM71)組的細胞活力和細胞侵襲率顯著增加，而細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)(圖10～11)。

2.8 miR-125a-5p靶向TRIM71調控凋亡基因表達和NF-κB p65的核轉位

與對照組相比， miR-125a-5p mimic組的U937和HL60細胞中TRIM71的蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。與對照組相比，miR-125a-5p mimic組的促凋亡蛋白Bax的表達水平升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平降低，nucleus NF-κB p65蛋白表達水平降低(P<0.05)。與對照組相比，pcDNA3.1-TRIM71組的Bax表達水平降低，Bcl-2和nucleus NF-κB p65蛋白表達水平升高(P<0.05)。與miR-125a-5p mimic組相比，(miR-125a-5p mimic+pcDNA3.1-TRIM71)組的nucleus NF-κB p65蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)(圖12～14)。

A.U937 cell apoptosis experiment (annexin-V-FITC/PI staining); B.HL60 cell apoptosis experiment (annexin-V-FITC/PI staining); C.statistical analysis of apoptosis rate; *P<0.05 compared with control group

A.relative expression of TRIM71 mRNA in bone marrow of healthy subjects and patients AML cells(n=20); *P<0.05 compared with control group; B.relative expression of TRIM71 mRNA in PBMC, U937 and HL60 cells (n=3); *P<0.05 compared with PBMC; #P<0.05 compared with U937

A.miR-214-5p and TRIM71 3′UTR region binding site; B. cells pGL3-TRIM71-WT and pGL3-TRIM71-MUT relative luciferase activity; C.HL60 cells pGL3-TRIM71-WT and pGL3-TRIM71-MUT relative luciferase activity; *P<0.05 compared with pGL3- TRIM71-MUT

A.expression of TRIM71 in AML cells after transfection; B.effect of up-regulating TRIM71 on the viability of AML cells; *P<0.05 compared with the pcDNA3.1-NC group

3 討論

miR-125a-5p在尿路上皮癌、胃癌、肺癌中發揮抑癌作用[5-8]。本研究顯示，在AML中miR-125a-5p被下調。上調miR-125a-5p明顯抑制了AML細胞的增殖和轉移。miRNA主要通過下調靶基因的表達在人類癌中發揮功能。本研究顯示，TRIM71是miR-125a-5p的潛在靶標。已知TRIM71是miRNA let-7的靶點，TRIM71可通過調節NF-κB信號通路促進癌細胞的增殖和轉移能力，充當癌基因的作用[11]。Chen等人研究顯示，TRIM71為新型突變體p53結合蛋白。TRIM71可誘導突變體p53的泛素化和蛋白酶體降解，并抑制突變體p53靶基因的廣泛表達，并且，抑制TRIM71可以在體外和體內抑制卵巢癌細胞的增殖[14]。然而，目前尚不清楚TRIM71在AML中的表達模式及功能。在本研究中，TRIM71在AML患者骨髓中高表達。上調TRIM71的表達促進了AML細胞的增殖和侵襲，但未影響細胞凋亡。此外，過表達TRIM71抑制了miR-125a-5p對AML細胞增殖、凋亡和侵襲的影響，

*P<0.05 compared with pcDNA3.1-NC group圖8 上調TRIM71對AML細胞系侵襲的影響Fig 8 Effect of up-regulation of TRIM71 on invasion of AML cell n=3)

A.effect of transfection of pcDNA3.1-TRIM71 on the apoptosis of U937 cells; B.effect of transfection of pcDNA3.1-TRIM71 on the apoptosis of HL60 cells; C.statistical analysis of apoptosis rate

這些結果說明miR-125a-5p對AML細胞的影響部分歸因于其對TRIM71的靶向抑制作用。我們推測，TRIM71被下調后，導致其下游的NF-κB信號通路被抑制，并減少了抑癌基因TP53的泛素化和蛋白酶體降解，從而抑制了腫瘤發生發展。然而，具體的作用機制還需要進一步研究。

A.effect of co-transfection of miR-125a-5p mimic and pcDNA3.1-TRIM71 on the invasion of U937 and HL60 cells; B.effect of co-transfection of miR-125a-5p mimic and pcDNA3.1-TRIM71 on the proliferation of U937 and HL60 cells; *P<0.05 compared with the control group; #P<0.05 compared with the miR-125a-5p mimic group

A.effect of co-transfection of miR-125a-5p mimic and pcDNA3.1-TRIM71 on the apoptosis of U937 cells; B.effect of co-transfection of miR-125a-5p mimic and pcDNA3.1-TRIM71 on the apoptosis of HL60 cells; C.statistical analysis of apoptosis rate; *P<0.05 compared with the control group; #P<0.05 compared with the miR-125a-5p mimic group

A.protein expression in U937 cells; B.protein expression in HL60 cells; *P<0.05 compared with miR-NC group圖12 上調miR-125a-5p對AML細胞系中TRIM71、Bax、Bcl-2和nucleus NF-κB p65蛋白表達的影響

A.protein expression in U937 cells; B.protein expression in HL60 cells; *P<0.05 compared with miR-NC group圖13 上調TRIM71對AML細胞系中Bax、Bcl-2和nucleus NF-κB p65蛋白表達的影響

NF-κB在許多癌的進展和發展中起重要作用[15-16]。NF-κB是一種轉錄因子，通過控制相關基因的表達來調節炎性反應、細胞增殖、侵襲和凋亡[13]。

*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with miR-125a-5p mimic 圖14 miR-125a-5p靶向TRIM71調控nucleusNF-κB p65蛋白表達Fig 14 miR-125a-5p targeting TRIM71 regulated nucleus NF-κB p65 protein expression

在正常生理條件下，NF-κB通過與蛋白質亞基IκBs結合而以無活性形式位于細胞質中。激活后，NF-κB從抑制性亞基上釋放，導致IκB-α磷酸化和降解，然后NF-κB p65的另一個亞基轉移到細胞核并調節靶基因的表達[17]。NF-κB在結直腸癌、胰腺癌等癌組織中顯著上調[18]。因此，抑制NF-κB可能是抗癌治療的一種新方法。另外，已證明NF-κB是一些惡性腫瘤中某些miRNA的靶基因，并且NF-κB信號通路調節多種細胞凋亡相關分子的表達。還有學者報道，TRIM71通過NF-κB通路調節非小細胞肺癌增殖和凋亡[11]。本研究結果表明，在AML細胞系中，miR-125a-5p通過靶向抑制TRIM71的表達來抑制NF-κB p65的核轉位，進而抑制了NF-κB信號通路的激活并抑制了細胞增殖。

綜上所述，本研究結果表明miR-125a-5p在AML患者的骨髓細胞中低表達，上調miR-125a-5p通過靶向抑制TRIM71來降低AML細胞系的增殖和侵襲并誘導凋亡。此外，miR-125a-5p可通過抑制NF-κB信號通路的活化來抑制AML細胞增殖。這些發現表明miR-125a-5p和TRIM71可能是AML的早期診斷和臨床治療分子靶點。