西南地區(qū)類風濕性關(guān)節(jié)炎患者Fas單核苷酸多態(tài)性與血清sFas水平相關(guān)

程曉剛，金 虹，陳 瑋，羅 丹，單 娟，徐 艷

(成都醫(yī)學院 免疫學教研室， 四川 成都 610500)

類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種臨床常見的風濕免疫頑疾，RA的發(fā)病與淋巴細胞和組織細胞細胞凋亡異常有關(guān)聯(lián)[1-3]。自殺相關(guān)蛋白(factor associated suicide，F(xiàn)as)為腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族成員，主要表達于激活的T細胞、B細胞、巨噬細胞、NK細胞、成纖維細胞等細胞表面，研究表明Fas介導的細胞凋亡與多種自身免疫病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。Fas多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征等自身免疫病相關(guān)[4-7]，并伴有血清可溶性Fas(soluble Fas，sFas)水平增高[7-8]。RA患者外周血存在sFas表達水平增高[2]，但其與Fas多態(tài)性的相互關(guān)系尚不清楚，且Fas多態(tài)性對RA的發(fā)生發(fā)展的影響尚未完全明確。本研究旨在采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)對類風濕性關(guān)節(jié)炎患者與健康對照組Fas單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphison,SNP)位點的多態(tài)性進行分析，并分析RA患者和健康人群外周血sFas水平，探索RA患者sFas水平與Fas多態(tài)性的相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2017年3月1日至2019年9月30日期間前來成都醫(yī)學院附屬醫(yī)院確診的類風濕性關(guān)節(jié)炎患者183例，其中男性59例，女性124例，年齡22～68歲，平均(43.6±11.9)歲。所有病例均符合美國風濕病協(xié)會(American Rheumatism Association，ARA)1987年修訂的RA診斷標準。患者的年齡、性別等詳細信息均從醫(yī)療記錄檢索，排除伴有其他自身免疫病等疾病。對照組采用同時期年齡和性別相匹配的健康人群195名，其中男性68名，女性127名，年齡21～72歲，平均(45.1±10.2)歲。對照組人群在1周內(nèi)無發(fā)熱或接受任何藥物治療，無懷孕、惡性腫瘤、慢性炎性疾病或結(jié)締組織疾病等慢性病史。RA組與健康對照組的性別、年齡、民族、類風濕因子等指標差異均無統(tǒng)計學意義。所有樣本均來自生活在西南地區(qū)的人群，該研究獲得成都醫(yī)學院醫(yī)學倫理委員會批準(2017-006)，所有研究對象均知情同意。

全外周血基因組DNA提取試劑(北京百泰克生物技術(shù)公司)；DNA聚合酶(北京天根生化科技公司)；限制性內(nèi)切酶(New England Biolabs公司)。引物由華大公司合成，sFas ELISA試劑(Biosource公司)，操作嚴格按照說明書進行。

1.2 方法

1.2.1 PCR-RFLP檢測Fas多態(tài)性:全外周血基因組DNA提取試劑提取樣本DNA，PCR-RFLP檢測Fas多態(tài)性。PCR反應條件：100 ng基因組DNA、0.2 μmol/L dNTP、上下游引物各0.5 μmol/L(Fas-670A/G，上游引物：5′-CTACCTAAGAGCTATCTA CCTTC-3′，下游引物：5′-GGCTGTCCATGTTGTGGCT GC-3′；Fas-1 377G/A上游引物：5′-TGTGTGCACAA GGTGGCGC-3′，下游引物：5′-TGCATCTGTCACTG CATTACCACCA-3′)、2.0 mmol/L MgCl2、10 mmol/L Tris HCl(pH=8.8)、2.5 U DNA聚合酶，總體積25 μL。反應溫度：94 ℃預變性 5 min，94 ℃變性30 s，退火30 s(Fas-670 A/G為56 ℃、Fas-1 377 G/A為55 ℃)，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次后，72 ℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶(Fas-670 A/G為MvaⅠ(37 ℃ 5 h)，F(xiàn)as-1 377 G/A為BstUⅠ (60 ℃ 4 h)，2.5%瓊脂糖凝膠電泳。隨機抽取20%的樣本和對照，基因測序驗證其正確性。

1.2.2 ELISA檢測外周血sFas蛋白水平:抽取類風濕性關(guān)節(jié)炎患者與健康對照人群每種基因型17～50例/名外周血5 mL，靜置后分離血清，用ELISA試劑盒檢測類風濕性關(guān)節(jié)炎與健康對照組外周血sFas水平，測試步驟嚴格按照試劑說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 測序驗證PCR-RFLP實驗結(jié)果

隨機分別選取40例RA患者和健康對照者樣品的PCR產(chǎn)物進行測序驗證，結(jié)果與PCR-RFLP結(jié)果完全一致(圖1)。

A.-1 377 AA genotyping；B.-1 377 GA genotyping；C.-1 377 GG genotyping； D.-670 GG genotyping； E.-670 AG genotyping； F.-670 AA genotyping

2.2 類風濕性關(guān)節(jié)炎患者組與健康對照組Fas多態(tài)性無顯著性差異

RA患者組和健康對照組的各基因型均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。Fas-1 377G/A和A/A型和-670G/G純合子變異在RA患者比健康對照組更常見，但與健康對照組相比，類風濕性關(guān)節(jié)炎患者Fas多態(tài)性差異無統(tǒng)計學意義，年齡與性別調(diào)整的回歸分析，亦無差異(表1)。

表1 類風濕性關(guān)節(jié)炎患者與對照組Fas多態(tài)性分析Table 1Fas polymorphisms in patients with RA and healthy controls

2.3 類風濕性關(guān)節(jié)炎患者組與健康對照組Fas多態(tài)性單倍型組合頻率分析

Fas-1 377G/A和-670A/G啟動子多態(tài)性的4種不同單倍型的組合：Fas-1 377G與-670A(GA)，-1 377G與-670G(GG)，-1 377A與-670G(AG)和-1 377A與-670A(AA)的單體型組合頻率在RA患者組與健康對照組差異均無統(tǒng)計學意義(表2)。

表2 類風濕性關(guān)節(jié)炎患者組與對照組Fas -1 377/-670基因多態(tài)性單倍型頻率分析Table 2 Association between Fas -1 377/-670 haplotypes in patients with RA and healthy controls

2.4 類風濕性關(guān)節(jié)炎患者組與健康對照組外周血sFas蛋白水平檢測

RA患者外周血血清sFas蛋白平均水平為(2.54±0.41)ng/mL，顯著高于健康對照組的(1.57±0.36)ng/mL(P<0.01)，比較健康對照組各基因型相對應的sFas水平，未發(fā)現(xiàn)sFas和Fas各基因型之間有顯著關(guān)聯(lián)，但RA組Fas-670 G/G純合子型患者的sFas平均水平為(2.37±0.29)ng/mL，比A/A型患者的(2.64±0.33)ng/mL較低(P<0.05)(表3)。

表3 類風濕關(guān)節(jié)炎患者組和健康對照者外周血sFas水平Table 3 sFas level in peripheral blood of patients with RA and healthy controls

3 討論

Fas為腫瘤壞死因子(TNF)家族成員，主要表達于激活的T細胞、B細胞、巨噬細胞、NK細胞、成纖維細胞等細胞表面，F(xiàn)as與其配體FasL(Fas ligand)結(jié)合可促使表達Fas的細胞凋亡。Fas mRNA通過不同剪切方式可分別產(chǎn)生膜表面Fas和血清可溶性Fas(sFas)，因此血清中sFas水平與Fas基因表達水平呈正相關(guān)，血清sFas水平可反映出細胞膜表面Fas水平。由于Fas的多態(tài)性不同，細胞膜表面Fas水平也有所差異，細胞膜表面Fas表達降低可引起淋巴細胞失衡、免疫機能紊亂、自身免疫耐受的失控而誘發(fā)自身免疫病[1-3]。

研究發(fā)現(xiàn)了Fas多態(tài)性與包括系統(tǒng)性狼瘡在內(nèi)的自身免疫性疾病之間的關(guān)系，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)、多發(fā)性硬化、原發(fā)性干燥綜合征，格林巴利綜合征(Guillain-Barre syndrom, GBS)等[4-9]。實驗結(jié)果顯示Fas-1 377(rs2234767)G/A和-670(rs1800682)A/G的多態(tài)性在健康對照組和RA患者組無顯著差異，因此Fas-1 377 G/A和-670 A/G多態(tài)性與RA疾病的發(fā)生似無顯著關(guān)聯(lián)，本實驗與某些相關(guān)文獻報道一致[10-11]，但也有不同[12]，其原因可能與實驗人群的地區(qū)分布、取樣差別及檢測人群的規(guī)模等有關(guān)。本實驗發(fā)現(xiàn)RA患者與健康者相比，血清sFas水平有顯著升高，且RA患者攜帶有Fas-670G/G基因型者較Fas-670A/A基因型者具有較低的血清sFas水平。相關(guān)研究也表明Fas啟動子區(qū)-670位A/A基因型較G/G基因型有超3倍的結(jié)合STAT1的能力，因此γ-干擾素(IFN-γ)可通過激活STAT1促進由Fas-670位A/A基因型受試者而非G/G基因型的受試者分離的單核細胞的Fas表達，在同時使用3種改善病情的抗風濕藥物(disease-modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs)治療的RA患者中更常伴隨有Fas-670G/G純合體基因型，且血清中的抗CCP抗體增多[10]。結(jié)合實驗結(jié)果，認為sFas水平與Fas-670位基因多態(tài)性有一定關(guān)系，F(xiàn)as-670G/G基因型會影響血清sFas及細胞表面Fas表達水平，進一步干擾細胞凋亡從而參與RA的發(fā)病進程或影響疾病的嚴重程度，因此認為RA患者在炎性和細胞因子等刺激下，細胞Fas表達增加可誘導淋巴細胞和多種組織細胞凋亡，但Fas-670G/G純合體基因型由于影響了Fas表達，淋巴細胞和組織細胞凋亡受阻因而可以促進類風濕性關(guān)節(jié)炎的病情。綜上所述Fas-1 377 G/A和-670 A/G多態(tài)性似與RA的發(fā)生無顯著相關(guān)性，但-670 G/G基因型可通過影響Fas表達從而影響疾病的發(fā)展。

本研究尚存一定缺陷：如類風濕性關(guān)節(jié)炎組和對照組樣本數(shù)相對較少；環(huán)境因素沒有納入觀察范圍，沒有進行基因多態(tài)性與環(huán)境相互作用的分析；未將其他生化指標納入檢測范圍等。因此需在來自不同地理區(qū)域的更大樣本數(shù)的人群中進行深入研究，以進一步闡明環(huán)境因素與類風濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展及Fas多態(tài)性之間復雜的相互作用。

志謝：感謝成都醫(yī)學院附屬醫(yī)院相關(guān)科室提供樣本及病歷資料。